Optimisation d’un test d’Expression de base d’ARN Multiplex à l’aide de documents d’archives de Cancer du sein

Approbation éthique pour l’utilisation de matériel tissulaire du sein dans cette étude a été obtenue de l’Université recherche éthique Comité (UREC) de l’Université de Malte (Ref : 22/2012). 1. préparation du tissu Aide appropriée H & E procédures14, préparer teinté référence des sections de tissu et numériquement numériser les diapositives pour référence au cours de la microdissection. À l’aide d’un microtome, coupes 20 µm tissus sur un bain d’eau exempte de RNAse à 40 ° C. Recueillir les sections sur des lames de la membrane pour microdissection laser utilisant des matériaux et équipements propres, RNase-décontaminés. Sécher les lames de la membrane à 37 ° C dans une étuve de séchage du jour au lendemain. Tache à l’aide de la procédure appropriée H & E15 avec des solutions de qualité de la biologie moléculaire et en augmentant le temps de coloration de l’hématoxyline à 6 min. Si nécessaire, tacher les diapositives de la membrane avec les protocoles d’immunohistochimiques appropriées16. 2. Microdissection laser Définir les limites de la diapositive et calibrer le mouvement de la scène. Déplacer la vue de laser sur une zone vide d’un glissement de la membrane. Calibrer la mise au point du laser en tirant d’un laser tourné à accroître les intervalles de mise au point (5 %) jusqu’à ce que le laser commence à percer à travers la membrane. Tirage au sort et microdissect toute forme et peaufiner la mise au point de laser pour maximiser l’efficacité du laser au cours de la dissection de laser. Augmenter la vitesse de déplacement de phase à un point où l’efficacité de la dissection du laser n’est pas compromise. Calibrer le laser à l’objectif choisi et recalibrer si la modification des objectifs (vitesse du laser à 1 à 15 %), la mise au point à 70 – 75 % et la puissance à 90 à 100 % lorsque vous utilisez l’objectif 4 X. Numérisez les diapositives de membrane teinté à l’aide de l’objectif 4 X. Sélectionnez et encercler les zones cibles pour microdissection sur la diapositive de la membrane. Laser de disséquer une superficie minimale de 42 mm2. Enregistrer la zone disséquées pour déterminer le volume de tampon homogénéisation de l’échantillon à utiliser. Utiliser le mécanisme de levage de cap pour récupérer la section disséquée sur les chapeaux de diffuseur de tubes étiquetés, jointe à l’appendice approprié. Si la section disséquée n’est pas trouvée sur le capuchon, répétez la dissection de laser de la zone. 3. tissu lyse Remarque : Plusieurs solutions et les matériaux sont fournis avec les kits mentionnés dans la Table des matières. Préparer le volume requis de mélange homogénéisation pour lyse d’échantillon à l’aide de la solution homogénéisation et la protéinase K à un ratio de 60 : 1. Distribuer 2,4 µL d’homogénéiser la solution dans chaque tube pour chaque 1 mm2 de la zone de tissu, Vortexer pendant 10 s à la vitesse maximale et centrifuger à température ambiante pendant 5 s à 2 500 g. Incuber dans un bloc de chauffage à 65 ° C pendant 12 à 18 h avec agitation à 600 tr/min. Centrifuger les lysats à 21 000 x g pendant 5 min à température ambiante. À l’aide d’une pipette, soigneusement aspirer le surnageant clair et verser dans un tube frais identifié. Éviter d’aspirer les fragments de tissus/membrane car cela pourrait réduire la qualité des résultats. Stocker le liquide clair surnageant dans un congélateur à-80 ° C. 4. essai hybridation Effectuer les préparations suivantes. Réchauffez le mélange de lyse en plaçant le flacon de réactif dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min et mélanger doucement à l’inversion. Si les homogénats de tissus sont figés, décongeler à température ambiante et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Vortex les échantillons à la vitesse maximale après l’incubation. L’incubateur agitateur à 54 ° C et y déposer la sonde de la trousse de validation de température dans un puits vide d’une plaque de 96 puits. Après 2 h vérifier la température sur le thermomètre numérique et régler la température de delta de secouer l’incubateur pour corriger tout écart de température. Dégel et vortex la sonde définie et blocage du réactif pendant 10 s, centrifuger à température ambiante pendant 5 s 2500 x g et de garder sur la glace. Garder le flacon de protéinase K sur la glace pendant l’utilisation. Laisser agir les perles de capture à 46 KHz pendant 3 min, puis vortex à la vitesse maximale pendant 3 min. Préparer un mélange de billes travail à 25 µL / puits de mise à l’échelle en conséquence des réactifs suivants : 4,25 µL d’eau exempte de nucléase, 16,65 µL du mélange de lyse, 1,00 µL de blocage réactif, 0,10 µL de protéinase K, 0,50 µL de capture perles 2,50 µL de sonde. Vortex du mélange de billes de travail pour 10 s à la vitesse maximale puis Pipetter 25 µL/puits dans la plaque de séparation magnétique. Prélever 25 µL homogénat de tissu à une plaque de 96 puits de séparation magnétique et 25 µL de solution aux 3 puits comme les blancs l’homogénéisation. Sceller la plaque de séparation magnétique à l’aide d’un joint de pression en plastique transparent et placer la plaque dans l’incubateur à 54 ± 1 ° C pendant 18 à 22 h et en agitant à 600 tr/min. Préparer un 1 X solution de tampon de lavage pour 24 puits en mélangeant 31,5 mL de RNase-libre de l’eau avec 0,1 mL de lavage tampon composant 1 et 1,67 mL de composant de tampon de lavage 2. Retirez la plaque de l’incubateur. Régler la température de l’incubateur à agitation à 50 ± 1 ° C. Monter la plaque de séparation magnétique sur la machine à laver à main plaque magnétique et verrouiller en place. Enlever le joint de la pression et attendre 1 min pour les billes magnétiques à régler. Lavage : Il faut inverser la plaque de séparation magnétique montée sur la plaque au-dessus de l’évier et la tache doucement sur un papier de soie pour enlever la solution résiduelle. À l’aide d’une pipette multicanaux ajouter 100 µL de solution tampon de lavage 1 X dans chaque puits et attendre 15 s. Répétez cette étape pour laver la plaque 3 fois. Distribuer 50 µL de réactif préamplificateur à chaque puits. Sceller la plaque avec un joint de la plaque d’aluminium et secouer la plaque à 800 tr/min pendant 1 min à température ambiante. Incuber pendant 1 heure à 50 ± 1 ° C en agitant à 600 tr/min. Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage). Distribuer 50 µL de réactif amplificateur dans chaque puits. Sceller la plaque avec un joint de la plaque d’aluminium et secouer la plaque comme dans l’étape 4.10. Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage). Vortex la sonde de l’étiquette pour 10 s à vitesse maximale. Ajouter 50 µL de la sonde de l’étiquette à chaque puits. Sceller et secouer la plaque (étape 4.10). Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage). Vortex la phycoérythrine streptavidine (SAPE) pour 10 s à vitesse maximale. Ajouter 50 µL de SAPE dans chaque puits. Sceller et secouer la plaque (étape 4.10). Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage) sauf utilisation du tampon de lavage SAPE au lieu de la solution tampon de lavage. Ajouter 130 µL de tampon de lavage SAPE à chaque puits et joint plaque avec un joint de la plaque d’aluminium. Secouer la plaque à 800 tr/min à température ambiante pendant 3 min. Démarrage de l’analyseur de billes magnétiques. Effectuer l’étalonnage et la vérification de routine en suivant les instructions du fabricant. Mettre en place un protocole sur l’analyseur de billes magnétiques utilisant les paramètres suivants : taille de l’échantillon : 100 µL ; DD porte : 5 000 – 25 000 ; Timeout : 90 s ; Région d’événement/perle perle : 100 ; puis cliquez sur suivant. Sélectionnez les nombres respectifs de perle dans le panneau et définissent les régions de perle avec les gènes cibles respectifs comme il est indiqué par le fabricant. Ajoutez une nouvelle analyse en sélectionnant «lot de créer en utilisant un protocole existant» dans l’onglet de lots . Dans le schéma désigner les puits comme inconnu ou vide, respectivement et fournissez une étiquette pour chaque échantillon dans le panneau d’échantillons . Retirer le joint de la plaque d’aluminium de la plaque de 96 puits de réaction. Éjecter le tiroir de la plaque en cliquant sur le bouton d’éjection , la plaque de charge dans l’analyseur de billes magnétiques. Cliquez sur se rétracter| Lot exécuter pour lancer l’analyseur. Après lecture, eject et retirez la plaque de 96 puits. Nettoyer et arrêter l’analyseur de billes magnétiques, tel que recommandé par le fabricant. 5. analyse Dans le lot| L’onglet résultats , sélectionnez le fichier d’analyse respectives et cliquez sur le bouton Exporter to.csv . Fichier de the.csv ouvert à l’aide d’un tableur. Observer les comtes de perle et omettre aucun résultat < 40 Perles/région. Moyenne des valeurs des blancs et de déterminer l’écart-type (SD) et la limite de détection (LOD) (vierges moyenne + (3xSD)) par gène cible. Définissez les valeurs inférieures à la limite de détection comme non détectés.Remarque : Si une des valeurs d’expression normalisant est non détectée, considérer les exemples de données inadéquates. Envisager de valeurs de l’expression plus 20 000 comme au-dessus de la limite de sensibilité supérieure. Les lysats de ces échantillons doivent être dilués et ré-analysés. Soustraire la moyenne vide de données brutes par gène. Calculer la moyenne géométrique des gènes sélectionnés normalisantes par échantillon. Normaliser les données de chaque échantillon à la moyenne géométrique respectif. Analyser les données sur les plates-formes de science de données ou en utilisant des algorithmes définis. Importer les données dans la plate-forme de science de données en cliquant sur Ajouter des données. Glissez le fichier de données dans l’ Espace de travail de processus et de se connecter à un opérateur [Sélectionnez attributs] , puis à un Principal analyse en composantes (PCA) opérateur et ensuite au port result. Dans l’ Attribut Select opérateur choisir le sous-ensemble de données normalisée de gène et une variable nominale comme sous-type de cancer du sein. Exécutez le processus en cliquant sur jouer. Dans l’onglet graphiques , sélectionnez le «Scatter couleur 3D» dans le style graphique et la variable nominale dans le champ couleur . Évaluer la variabilité de données APC sur un terrain en 3 dimensions.