Optimalisatie van een Multiplex RNA gebaseerde expressie-Assay met behulp van borst kanker archiefmateriaal

Ethische goedkeuring voor het gebruik van borst weefsel materiaal in deze studie werd verkregen van de Universiteit onderzoek ethische Commissie (UREC) van de Universiteit van Malta (Ref: 22/2012). 1. de weefsels voorbereiding Met behulp van passende H & E procedures14, bereiden gebeitst referentie weefselsecties en digitaal scannen van dia’s voor verwijzing tijdens microdissection. Gebruikend microtome, cut 20 µm weefsels secties op een waterbad RNAse-gratis bij 40 ° C. Verzamelen in de secties over membraan dia’s voor laser-microdissection met behulp van schone, RNase-ontsmet apparatuur en materialen. De membraan dia’s bij 37 ° C in een droogrek incubator’s nachts droog. Vlek met behulp van de juiste H & E procedure15 met moleculaire biologie grade oplossingen en het vergroten van de kleuring tijd van Haematoxyline tot 6 min. Indien nodig, vlek de membraan dia’s met de juiste immunohistochemische protocollen16. 2. laser Microdissection Stel de dia en kalibreren van de fase-beweging. De weergave van de laser op een leeg gebied van de dia van een membraan verplaatsen. Kalibreer de laser focus door het afvuren van een laser focus intervallen (5%) te verhogen tot de laser begint te doorboren via het membraan beschoten. Loting en microdissect elke vorm en finetune de laser focus op het maximaliseren van de efficiëntie van de laser tijdens de dissectie van de laser. Verhoog de snelheid van de fase-beweging tot een punt waar de laser dissectie efficiëntie geen afbreuk wordt gedaan. Kalibreren van de laser op het geselecteerde objectief en als het veranderen van de doelstellingen (laser tempo 1 – 15%), focus op 70-75%, en macht op 90-100% wanneer het streven naar 4 X opnieuw te kalibreren. Scan de gebeitst membraan dia’s met behulp van de 4 X doelstelling. Selecteer en omsingelen van de doelgebieden voor microdissection op de dia membraan. Laser ontleden een minimumoppervlakte van 42 mm2. Record het gebied ontleed om te bepalen van de omvang van de steekproef homogenisator buffer te worden gebruikt. Het GLB lift mechanisme gebruiken om op te halen de ontleed sectie op de diffusor caps van gelabelde buizen aangesloten op de juiste aanhangsel. Als de ontleed sectie wordt niet opgehaald op het GLB, herhaal de dissectie van de laser van het gebied. 3. de weefsels Lysis Opmerking: Diverse oplossingen en materialen worden geleverd samen met kits die zijn vermeld in de Tabel van materialen. Bereid het vereiste homogenisator mengsel volume voor lysis van de monster met behulp van homogenisatie oplossing en proteïnase K bij een verhouding van 60:1. Pipetteer 2.4 µL van homogenisatie oplossing in elk buisje voor elke 1 mm2 van weefsel gebied, vortex voor 10 s bij de maximale snelheid, en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 s bij 2.500 x g. Bebroed in een blok van de verwarming bij 65 ° C gedurende 12 – 18 h met schudden bij 600 omwentelingen per minuut. Centrifugeer het lysates bij 21.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Met behulp van een precisiepipet, zorgvuldig gecombineerd het duidelijke supernatant en afzien in een gelabelde verse buis. Vermijd aspirating van het weefsel/membraan fragmenten zoals kan hierdoor de kwaliteit van de resultaten. Bewaar het supernatant helder in een vriezer-80 ° C. 4. op kruising gebaseerde Assay De volgende preparaten uit te voeren. Vooraf het mengsel lysis te warm door het plaatsen van de fles reagens in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten en meng zachtjes door inversie. Als de homogenates van het weefsel zijn bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. Vortex de monsters op de maximale snelheid na de incubatie. De schudden incubator vastgesteldop 54 ° C en breng de sonde van de temperatuur validatie kit in een lege putje van een 96-wells-plaat. Na 2 uur controleren van de temperatuur op de digitale thermometer en stel de temperatuur van de delta van schudden incubator om te corrigeren voor eventuele temperatuurverschil. Dooi en vortex de sonde instellen en het blokkeren van reagens voor 10 s, centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 s bij 2.500 x g en houd op ijs. Houd de flacon proteïnase K op ijs tijdens gebruik. Bewerk ultrasone trillingen ten de parels van de vangst op 46 KHz voor 3 min, vervolgens vortex bij de maximumsnelheid voor een andere 3 min. Bereiden van een 25 µL werken kraal mix per putje door schaalvergroting de volgende reagentia dienovereenkomstig: 4,25 µL Nuclease-gratis water, 16.65 µL van lysis mengsel, 1.00 µL van het blokkeren van reagens 0,10 µL van proteïnase K, 0,50 µL van capture kralen, 2,50 µL van sonde set. Vortex de werkende kraal mix voor 10 s ter maximum-vaart, pipetteer dan 25 µL per putje in de magnetische scheiding plaat. Pipetteer 25 µL weefsel homogenaat een magnetische scheiding 96-wells-plaat en 25 µL homogenisatie oplossing voor 3 wells als de blanks. Afdichting van de plaat van de magnetische scheiding met behulp van een doorzichtige plastic Perspakking en plaats van de plaat in de incubator bij 54 ± 1 ° C voor 18-22 h terwijl het schudden bij 600 omwentelingen per minuut. Bereiden een 1 X wassen bufferoplossing voor 24 putten door 31.5 mL RNase-gratis water te vermengen met 0,1 mL van wash wassen buffer component 2 component 1 en 1,67 mL buffer. Verwijderen de plaat uit de incubator. De temperatuur van de schudden incubator ingesteld op 50 ± 1 ° C. De magnetische scheiding plaat op de wasmachine hand-held magnetische plaat monteren en vergrendelen. Verwijder de Perspakking en wacht 1 minuut voor de magnetische kralen te regelen. Wassen stap: Omkeren de magnetische scheiding plaat gemonteerd op het bord boven de wastafel en de vlek voorzichtig op een papieren zakdoekje te verwijderen van de resterende oplossing. Met behulp van een meerkanaalspipet Voeg 100 µL van 1 X wassen bufferoplossing in elk putje en wacht 15 s. Herhaal deze stap om de plaat 3 keer wassen. Pipeteer 50 µL van het reagens voorversterker aan elk putje. Afdichting van de plaat met een aluminium plaat zegel en schud de plaat bij 800 rpm voor 1 minuut bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 ± 1 ° C terwijl het schudden bij 600 omwentelingen per minuut. Herhaal stap 4.9 (wassen stap). Pipeteer 50 µL van het reagens van de versterker aan elk putje. Afdichting van de plaat met een aluminium plaat zegel en schud de plaat stap 4.10. Herhaal stap 4.9 (wassen stap). Vortex de label sonde voor 10 s op maximale snelheid. Aan elk putje 50 µL van de sonde label toevoegen Afdichting en schud de plaat (stap 4.10). Herhaal stap 4.9 (wassen stap). Vortex de streptavidine phycoerythrin (SAPE) voor 10 s op maximale snelheid. Voeg 50 µL van SAPE toe aan elk putje. Afdichting en schud de plaat (stap 4.10). Herhaal stap 4.9 (wassen stap) behalve gebruik de SAPE was buffer in plaats van de bufferoplossing wassen. Voeg 130 µL van SAPE was buffer aan elk goed en zegel plaat met een aluminium plaat zegel. Schud de plaat bij 800 rpm bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. Start-up de magnetische kraal analyzer. Het uitvoeren van de calibratie and verificatie routinematige door het volgen van de instructies van de fabrikant. Een protocol betreffende de magnetische kraal-analyzer met behulp van de volgende parameters instellen: de grootte van steekproef: 100 µL; DD Gate: 5.000-25.000; Time-out: 90 s; Kraal gebeurtenis/kraal regio: 100; en klik op volgende. Selecteer de nummers van de respectieve parel in het deelvenster en de gebieden van de kraal met de respectieve doelgenen zoals aangegeven door de fabrikant definiëren. Voeg een nieuwe analyse door in het partijen tabblad ‘Batch maken met behulp van een bestaand protocol’ te selecteren. In de indeling van de plaat wijst de putten als onbekend of Blanco, respectievelijk en voorzien van een label voor elk monster in het deelvenster stalen . Verwijder de aluminium plaat zegel uit de reactie van de 96-wells-plaat. De plaat dienblad uitwerpen door te klikken op de Eject -knop, de plaat in de magnetische kraal analyzer laden. Klik op intrekken| Batch uitgevoerd tot de analyzer. Na de lezing uitwerpen en verwijder de 96-wells-plaat. Schoon en dicht waas de magnetische kraal analyzer, zoals aanbevolen door de fabrikant. 5. de gegevensanalyse In de Batch| Resultaten tab, selecteer het respectieve analyse-bestand en klik op de knop exporteren to.csv . Open the.csv bestand met behulp van een spreadsheet-software. Observeren van de graven van de kraal en geen resultaten met < 40 kralen/regio weglaten. Gemiddelde van de waarden van de lege putten en uitwerken van de standaarddeviatie (SD) en de limiet van detectie (LOD) (blanco gemiddelde + (3xSD)) per doel-gen. Stel de waarden lager zijn dan de LOD als onopgemerkt.Opmerking: Als aan het normaliseren van de expressie waarden zijn onopgemerkt, de voorbeeldgegevens als onvoldoende beschouwen. Overwegen expressie waarden meer dan 20.000 als over de bovenste gevoeligheid te beperken. De lysates van deze monsters moeten worden verdund en opnieuw geanalyseerd. Het lege gemiddelde van de ruwe gegevens per gene aftrekken. Berekent het meetkundige gemiddelde van de geselecteerde normaliserend genen per monster. Normaliseren van individuele voorbeeldgegevens aan de respectieve meetkundige gemiddelde. Analyseren van de gegevens op gegevens wetenschap platforms of met behulp van algoritmen gedefinieerd. Importeer de gegevens in de wetenschap dataplatform door te klikken op Gegevens toevoegen. Sleep het gegevensbestand in de Werkruimte van het proces en aan een marktdeelnemer [Selecteer kenmerken] vervolgens verbinding te maken met een belangrijkste componenten analyse (PCA) exploitant, en vervolgens naar de result poort. Selecteer de subset met gegevens van de genormaliseerde gen en een nominale variabele zoals borst kanker subtype in het Kenmerk Select exploitant. Het proces uitvoeren door te klikken op spelen. Selecteer in het tabblad grafieken de “verstrooien 3D kleur” in de stijl van de grafiek en de nominale variabele in het kleurveld . Beoordelen van de variabiliteit van de gegevens PCA op een 3-dimensionale perceel.