الأمثل للتحليل متعدد التعبير المستندة إلى الجيش الملكي النيبالي استخدام المواد الأرشيفية سرطان الثدي
Summary
تدهور الحمض في الأنسجة المحفوظات والتغاير الورم وعدم وجود عينات الأنسجة المجمدة الطازجة يمكن أن يؤثر سلبا على خدمات تشخيص السرطان في مختبرات علم الأمراض في جميع أنحاء العالم. ويصف هذه المخطوطة الاستفادة المثلى من لوحة المؤشرات الحيوية باستخدام مقايسة حبة مغناطيسية متعدد لتصنيف سرطان الثدي.
Abstract
تدهور الحمض في الأنسجة المحفوظات والتغاير الورم وعدم وجود عينات الأنسجة المجمدة الطازجة يمكن أن يؤثر سلبا على خدمات تشخيص السرطان في مختبرات علم الأمراض في جميع أنحاء العالم. تضخيم الجينات والتعبير التشخيص اختبار باستخدام المواد الأرشيفية أو المواد التي تتطلب النقل لخدمة المختبرات، يحتاج اختبار أكثر قوة ودقة تتكيف مع مهام سير العمل السريرية الحالية. لدينا فريق البحث الأمثل استخدام إينفيتروجين™ كوانتيجيني™ من نوع Plex المقايسة (الحرارية فيشر العلمية) تحديد حجم الجيش الملكي النيبالي في المواد المحفوظة باستخدام تكنولوجيا تشعبت الحمض النووي (بدنا) على لوميناكس xMAP® المغناطيسي الخرز. تحليل التعبير الجيني الموصوفة في هذه المخطوطة هو طريقة سريعة، ومتعدد رواية، التي يمكن أن تصنف بدقة سرطان الثدي في مختلف الأنواع الفرعية الجزيئية، إهمال الموضوعية لتفسير المتأصلة في تقنيات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب المدخلات المنخفضة للمواد المطلوبة، أورام غير متجانسة يمكن ميكروديسيكتيد الليزر باستخدام الهيماتوكسيلين والملون ويوزين (H & E) أقسام. يحتوي هذا الأسلوب على مجموعة واسعة من التطبيقات الممكنة بما في ذلك تصنيف الورم مع إمكانية تشخيص وقياس المؤشرات الحيوية في خزعات السائلة، مما يتيح إدارة أفضل للمرضى ورصد الأمراض. وبالإضافة إلى ذلك، قياس كمي للمؤشرات الحيوية في المواد الأرشيفية مفيدة في أبحاث علم الأورام مع الوصول إلى مكتبات المواد المشروح سريرياً، والتي يمكن التحقق من الدراسات الاستعادية المؤشرات الحيوية المحتملة ونتائجها السريرية الارتباط.
Introduction
الأمثل لفحوصات الحمض النووي الريبي على أساس استخدام الفورمالين–الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) المواد الأرشيفية تحديا بسبب تقلب في المعالجة الجراحية الأنسجة وتحلل الحمض النووي الريبي الناجمة عن الفورمالين التي تستخدم للحفاظ على سلامة الأنسجة1، 2. للتغلب على الحد من إجراء دراسات التعبير الجيني دقيقة من المواد الأرشيفية، تستخدم مجموعتنا المقايسة حبة المغناطيسية متعدد بدنا. بدلاً من الانزيمية التضخيم من قالب المستهدفة، يستخدم تكنولوجيا بدنا تهجين تحقيقات محددة والتضخيم من إشارة مراسل3. تسلسلات الاعتراف قصيرة من المسابر الالتقاط والكشف عن مصممة هجن إلى أجزاء قصيرة من هدف الجيش الملكي النيبالي4. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام أنسجة هوموجيناتيس كمواد البدء مباشرة في هذا التحليل، يتغلب على الخسارة الحتمية للجيش الملكي النيبالي أن النتائج من الاختبارات التي تتطلب استخراج الحمض النووي الريبي السابقة وتنقية. تضخيم الإشارات واستخدام تسلسلات الاعتراف قصيرة، واستبعاد خطوة التنقية، تسهم في التقليل في الاختلاف التقني للمقايسة. التكنولوجيا يوفر إمكانية متعدد المقايسة (أهداف الجيش الملكي النيبالي يصل إلى 80)، وقياس التعبير عن فريق أهداف من مواد منخفضة المدخلات. ويصف هذا البروتوكول الإعداد وتلطيخ عينات الأنسجة لليزر ميكروديسيكشن. تلطيخ على الشرائح غشاء تسهيل تصوير الورم وبنية نسيجية لتوفير دقة التحديد وتوصيفها: (1) الورم والقنوات العادية في أنسجة الثدي، و (2) استنساخ الخلايا الخبيثة داخل الأورام غير متجانسة.
التصنيف الجزيئي لسرطان الثدي هو عملية أن يستجوب الواسمات الجزيئية لتصنيف أورام المرضى إلى ثلاث فئات الجزيئية، أي، مستقبلات عامل نمو البشرة لومينال، الإنسان 2 (HER2)-النوع الفرعي للتخصيب، والقاعدية. النوع الفرعي HER2 أثري يعرف جيدا، مع التعبير عالية من مستقبلات HER2، سبب التضخيم الجيني ERBB2، جنبا إلى جنب مع انخفاض أو غياب مستقبلات الإستروجين (ER) ومستقبلات البروجسترون (المدعي). النوع الفرعي لومينال إيجابي عموما ER والنوع الفرعي القاعدية هي النفي العام لثلاث مستقبلات (HER2، ER، مكتب المدعي العام الاتحادي)، وإلى حد كبير التداخل مع5،النوع الفرعي لتشخيص السرطان (تنزانيا) الثدي السلبي الثلاثي6. يتم استخدام علامات أخرى لتحديد الخصائص الظهارية والوسيطة. فيبرونيكتين (FN1) عنصر الرئيسي لمقصورة الوسيطة أنسجة الثدي. ويرافق زيادة FN1 التعبير Ki67 عالية تلطيخ، ويظهر توقيع لورم أكثر الغازية7،8 ويرتبط بورم خبيث9. من المثير للاهتمام، تم العثور على FN1 أن تكون موجودة في ميكروفيسيكليس التي تنشأ من الخلايا السرطانية، أن فعل تنشيط إشارات ميتوجينيك في الخلايا الليفية المستفيدة10. ومن ثم تعميم ميكروفيسيكليس مثل اكسوسوميس هي علامة محتملة للكشف المبكر أو ورم خبيث والانتكاس11.
وقد أجريت متكرر الورم منطقة التحديد لسرطان الثدي النسخي subtyping ماكروديسيكشن12،13. للتغلب على عدم تجانس الأنسجة وزيادة الحساسية، جمعنا بين الكلاسيكية الأنسجة تلطيخ مع متعدد أساليب التنميط الجزيئي موثوق بها. كدليل على المبدأ، حددت اثنين من استنساخ سرطان الثدي متميزة بالتوقيع الوسيطة الظهارية وإمكانات المنتشر. يمكن ترجمتها إلى الإعداد السريرية الحالية سير عمل بروتوكول وصف وتستخدم لعزل بشكل انتقائي وتميز الأنسجة الأنواع الفرعية استخدام التنميط مرناً المستهدفة بسهولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الأمثل مقايسة على أساس حبة بدنا متعدد لقياس التعبير الجيني في الجيش الملكي النيبالي المتدهورة المستمدة من أنسجة سرطان الثدي فب وقنوات الثدي العادي. الأمثل المقايسة، ينطوي عليها تطوير خوارزمية لتصنيف أورام سرطان الثدي في المخططات لومينال والقاعدية استخدام المؤشرات الحيوية المعروفة 8 و 5 المحتملة تطبيع الجينات. تم تطبيع البيانات باستخدام التباديل الجينات تطبيع. اختيار الجينات تطبيع استند التنبؤ بأفضل حالة مستقبلات استخدام الجينات المصنف لومينال/القاعدية. لتصنيف الأنواع الفرعية لومينال/القاعدية من الأنسجة FFPE، تم تحديد الجينات تطبيع بيتا-أكتين (أكتب) ونازعه 3-فوسفات جليسيرالديهيدي (جابده) هيبوكسانثيني فوسفوريبوسيلترانسفيريز 1 (HPRT1).
الطريقة التي يمكن تكييفها للاستخدام في التشخيص الأخرى ومجالات البحث بعد الاختيار الملائم لمجموعة الجينات تطبيع. هو أحد التطبيقات الهامة لهذا الأسلوب في قطاع البحوث بقياس المؤشرات الحيوية في المواد الأرشيفية التي هي مشروحة جيدا مع النتائج السريرية. هذا يمكن التحقق من صحة علامات تنبؤية المحتملة في الدراسات الاستعادية، بسرعة ودقة، وتجنب دراسات مستقبلية طويلة الأجل في انتظار البقاء خالية من الأمراض، وبقاء البيانات الشاملة. حاليا لدينا فريق التحقيق استخدام الفحص للكشف عن اكسوسوميس مستقبلات إيجابية، الأمر الذي يتطلب تطوير جديد باستخدام خوارزمية بديل تطبيع الجينات لتطبيع البيانات. استخدام الخزعات السائلة وفحوصات التعبير الجيني قوية سيسمح فحوصات عالية الإنتاجية متعدد تكييفها لإدارة المريض أثناء العلاج، وتوفر وسيلة لتتبع نجاعة العلاج، احتمال الانتكاس بسبب مقاومة للعلاج، قدرة الورم المنتشر.
هذا الأسلوب أيضا مجموعة واسعة من التطبيقات الممكنة في تشخيص الأورام وهو يتكيف مع سير العمل الحالي التشخيص. وتشمل المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب في مجال التشخيص: (1) تنفيذ فحوصات عالية الإنتاجية، (2) باستثناء الذاتية ونتائج ملتبسة منشؤها القياسات المستندة إلى الصور، (3) كشف دقيق لأهداف متعددة في نفس الوقت، الذي يعزز دقة والتقليل من استخدام عينات المرضى الثمينة، و (4) لا يشترط لمرافق متخصصة للغاية والموارد البشرية. عملية أخذ العينات الأمثل، جنبا إلى جنب مع مدخلات منخفضة من المواد اللازمة للتحليل متعدد المستندة إلى حبة، يسمح مواصلة التحقيق في عدم تجانس الورم؛ باستخدام ميكروديسيكشن الليزر لفصل دقة بؤر متعددة من الأنسجة الخبيثة من الجزء المريض نفسه، من الممكن مقارنة متعددة الجينات فيما بينها وكذلك مع أنسجة طبيعية المتطابقة (الشكل 4). انخفاض المدخلات المادية أمرا حيويا لتطبيق التشخيص في ورم الخزعات التي توفر الأنسجة السرطانية محدودة. قدرة التحليل لقياس التعبير الجيني من عينات الحمض النووي الريبي المتدهورة يتيح سهولة نقل العينات للتحليل داخل مؤسسة أو إلى خدمات المختبرات. وباﻹضافة إلى ذلك، تحليل المقطع كله كان أيضا إمكانية استخدام ح & ه الملون المادية (الشكل 1).
لنجاح هذا البروتوكول، فمن الضروري: (1) ضمان مناسب لأخذ العينات من الموقع الورم/s التي هي تفكيك للمقايسة و (2) وضع الأمثل، والتحقق من صحة خوارزميات تطبيع البيانات، لكل فريق التعبير الجيني و/أو التنبؤات الفردية أو المؤشرات الحيوية التنبؤية. السابقة يعتمد على الخبرة التقنية للفني/الباحث إجراء أخذ العينات. من المستحسن اتخاذ أساسية إضافية وإعداد ميكرواري أنسجة (تي أم أية) بنفس الشكل للمقايسة حبة المغناطيسية متعدد (96-كذلك تنسيق). وهذا سيوفر أرشيف لمواقع الورم كنسخة طبق الأصل عينات المستخدمة للتحليل القائم على الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا تقييم طرفية مع تقنيات أخرى لمتابعة البحث أو للتحقق من النتائج. تطوير خوارزميات التطبيع تعتمد على المواد التي يجري التحقيق فيها وتطبيع الجينات المحددة للتطبيع. لوحات مختلفة لتطبيع الجينات المحددة على أساس مستوى وتنوع التعبير في العينة التي تم تحليلها، وهذا يختلف بين أنسجة السرطان من أصول مختلفة، واكسوسوميس من البلازما، أو تعميم الخلايا السرطانية. التحقق من الصحة للفحص يشمل تجهيز العينة نظراً للاستعدادات المختلفة سوف يؤدي أيضا إلى خوارزميات مختلفة التطبيع.
وباختصار، استخدام التكنولوجيا بدنا في تركيبة مع حبة المغناطيسي التكنولوجيا واختيار الفريق المناسب للجينات المستهدفة، وسيوفر ميزة إضافية لقياس التعبير الجيني مباشرة في أنسجة ليساتيس المستمدة من كميات صغيرة من المريض المادية، بما في ذلك ميكروديسيكتيد اكسوسوميس والمادية، وتعميم الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى الكشف عن تغاير الورم، إمكانات الاستخدام السليم للوحات للكشف عن اكسوسوميس الورم المشتقة للتشخيص المبكر والكشف المبكر عن حالات الانتكاس. إذ ليس هناك حاجة لخطوة تضخيم حمض النووي، تضخيم الإشارات باستخدام التكنولوجيا بدنا، جنبا إلى جنب مع متعدد المستندة إلى حبة، تدابير متعددة من التعبير الجيني في المواد الأرشيفية المشروح سريرياً وتوفير مورد التحقق من صحة العلامات البيولوجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده في العمل (1) “الثدي السرطان المشروع منحة دراسية” (2014-2016) الممولة من العمل لمؤسسة سرطان الثدي و 2013 على قيد الحياة من خلال البحوث والابتكار وتنمية الثقة (ريدت) من جامعة مالطة، (2) “كلية الطب” & الجراحة، جامعة مالطة والمشروع (3) قانون بتمويل من “المجلس الوطني المالطي” للعلوم والتكنولوجيا من خلال الانصهار: R وتكنولوجيا تطوير برنامج عام 2016. نشر هذه المخطوطة معتمد من خلال المنحة لوميناكس جوف.
Materials
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
| Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
| Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
| Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
| ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
| HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
| Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
| Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
| Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
| mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
| mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
| Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
| mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
| 1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
| 96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
| Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
| LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
| Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit – FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
| Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
| Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
| Sonicator | Silvercrest | ||
| RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
| Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
| RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
| Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |
References
- Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
- Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
- Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
- Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
- Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes–dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
- Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, S60-S64 (2010).
- Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
- Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
- Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
- Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
- Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
- Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
- Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Lin, F., Prichard, J. . Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , (2011).
- Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).
