Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila
Summary
Este protocolo se centra en el análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila, que puede ser utilizado para estudios de morfogénesis dendríticas.
Abstract
Las dendritas son las proyecciones ramificadas de la neurona, y morfología dendrítica refleja organización sináptica durante el desarrollo del sistema nervioso. Arborización dendrítica neuronal (da) de larvas de Drosophila es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis de las dendritas neuronales y funciones de los genes en el desarrollo del sistema nervioso. Hay cuatro clases de neuronas da. Clase IV es el más complejo con un patrón de ramificación que cubre casi toda la zona de la pared del cuerpo larval. Anteriormente hemos caracterizado el efecto de silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5 en clase de complejidad de la arborización dendrítica neuronal del IV (NDAC) utilizando cuatro parámetros: la longitud de las dendritas, la superficie de la cobertura de la dendrita, el número total de ramas y la estructura de ramificación. Este protocolo presenta el flujo de trabajo de análisis cuantitativo NDAC, consisten en larvas disección, microscopia confocal y procedimientos de análisis de imagen usando el software ImageJ. Más penetración en el desarrollo neuronal de da y sus mecanismos subyacentes mejorará la comprensión de la función neuronal y proporcionar pistas sobre las causas fundamentales de neurológico y trastornos del neurodesarrollo.
Introduction
Las dendritas, que son las proyecciones ramificadas de la neurona, cubren el campo que abarca entradas sensoriales y sinápticas de la neurona de otras neuronas1,2. Las dendritas son un componente importante de la formación de sinapsis y juegan un papel crítico en la integración de entradas sinápticas, así como propagar el estímulo electroquímico en una neurona. Arborización dendrítica (da) es un proceso por el cual las neuronas forman nuevos árboles dendríticos y ramas para crear nuevas sinapsis. El desarrollo y la morfología de la da, como rama densidad y patrones de agrupación, resultan de procesos biológicos de múltiples pasos y están altamente correlacionados con la función neuronal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para el análisis cuantitativo de la complejidad de arborización neuronal dendritric en Drosophila.
La complejidad de las dendritas determina los tipos sinápticos, conectividad y entradas de las neuronas de la pareja. Patrones de ramificación y la densidad de las dendritas están involucrados en el procesamiento de las señales que convergen en el campo dendrítico3,4. Las dendritas tienen la flexibilidad para el ajuste en el desarrollo. Por ejemplo, señalización sináptica tiene un efecto en la organización de la dendrita en las neuronas somatosensoriales durante la fase de desarrollo y en el sistema nervioso maduro5. El establecimiento de la conectividad neuronal se basa en la morfogénesis y maduración de las dendritas. Malformación de las dendritas se asocia con deterioro de la función neuronal. Los estudios han demostrado que la anormalidad de la morfogénesis de la neurona da podría contribuir a las etiologías múltiples enfermedades neurodegenerative, incluyendo enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), y enfermedad de Lou Gehrig / Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)6,7,8. Alteraciones sinápticas aparecen en la etapa temprana de la EA, en concierto con la decadencia y la debilitación de la neurona función7,8. Sin embargo, los detalles de cómo patología dendrita contribuye a la patogénesis de estas enfermedades neurodegenerativas sigue siendo elusiva.
El desarrollo de las dendritas está regulado por los genes que codifican una compleja red de reguladores, como la familia Wnt de proteínas9,10, factores de transcripción y ligandos de receptores de superficie celular11,12 . Drosophila da las neuronas consisten en cuatro clases (clase I, II III, IV), de que clase IV da neuronas tienen los patrones de ramificación más complejos y han sido utilizadas como un potente sistema experimental para la mejor comprensión morfogénesis13, 14. Durante la morfogénesis temprana, sobreexpresión o ARNi silenciamiento de genes en neuronas de clase IV da como resultado cambios en los patrones de ramificación y poda de dendrita13. Es importante desarrollar un método práctico para el análisis cuantitativo de la arborización dendrítica neuronal.
Previamente hemos demostrado que silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5, Sox102F, condujo a más cortas dendritas de las neuronas de da y menor complejidad en clase IV da neuronas15. Aquí, presentamos el procedimiento de análisis cuantitativo para la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila. Este protocolo, adaptado de la metodología anterior descrita, proporciona un método breve para analizar el desarrollo de las neuronas sensoriales da. Ilustra la imagen robusta de etiquetado y de las neuronas da en el tercer estadio larval de cuerpo de pared16,17,18,19. Es un protocolo de valioso para los investigadores que deseen investigar la NDAC y diferencias del desarrollo en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las dendritas que inervan la epidermis son las regiones de entrada de las neuronas y sus morfologías determinan cómo la información es recibida y procesada por neuronas individuales. Morfología de dendrita de desarrollo refleja la modulación genética de la organización de la dendrita. La Drosophila larvas da neurona del sistema nervioso periférico es un importante modelo para el estudio de desarrollo de la dendrita debido: 1) la similitud funcional con mamíferos11,<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a William A. Eimer por proyección de imagen de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondo el cura de Alzheimer [R.E.T], el Instituto Nacional de salud [R01AG014713 y R01MH60009 en la R.E.T; R03AR063271 y R15EB019704 a A.L. y la Fundación Nacional de ciencia [NSF1455613 a A.L.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
References
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer’s disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer’s disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
