Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile
Summary
Ce protocole met l’accent sur l’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile, qui peut être utilisé pour l’étude de la morphogenèse dendritique.
Abstract
Dendrites sont les projections ramifiées d’un neurone et morphologie dendritique reflète une organisation synaptique au cours du développement du système nerveux. Drosophila larvaire arborisation dendritique neuronale (da) est un modèle idéal pour l’étude de la morphogénèse des dendrites neurales et la fonction des gènes dans le développement du système nerveux. Il existe quatre classes de neurones dopaminergiques. Classe IV est la plus complexe avec une ramification qui couvre presque toute la surface de la paroi corporelle larvaire. Précédemment, nous avons caractérisé l’effet de faire taire les orthologues de drosophile de SOX5 sur la classe de complexité d’arborisation dendritique neuronale IV (NDAC) à l’aide de quatre paramètres : la longueur des dendrites, la superficie de la couverture de la dendrite, le nombre total de branches et la structure de ramification. Ce protocole présente le flux de travail de l’analyse quantitative NDAC, composée de larve dissection, microscopie confocale et procédures d’analyse image à l’aide de logiciels ImageJ. Autre aperçu da développement neuronal et ses mécanismes sous-jacents améliorera la compréhension de la fonction neuronale et fournir des indices sur les causes fondamentales de neurologiques et de troubles du développement neurologique.
Introduction
Les dendrites, qui sont les projections ramifiées d’un neurone, couvrent le champ qui englobe sensoriel et synaptique apports le neurone des autres neurones1,2. Dendrites sont une composante importante de la formation des synapses et jouent un rôle essentiel dans l’intégration des entrées synaptiques, ainsi que la stimulation électrochimique dans un neurone de multiplication. Arborisation dendritique (da) est un processus par lequel les neurones forment de nouveaux arbres dendritiques et des branches pour créer de nouvelles synapses. Le développement et la morphologie des da, comme la densité de la branche et modes de regroupement, résultent de plusieurs étapes des processus biologiques et sont fortement corrélées à la fonction neuronale. Le but du présent protocole est de fournir une méthode d’analyse quantitative de la complexité de ces dendritric neuronale dans Drosophila.
La complexité des dendrites détermine les types synaptiques, la connectivité et apports des neurones de la partenaire. Patrons de ramification et la densité des dendrites sont impliqués dans le traitement des signaux qui convergent sur le champ dendritiques3,4. Dendrites ont la souplesse d’adaptation en développement. Par exemple, signalisation synaptique influe sur l’organisation de la dendrite dans le neurone somatosensoriel pendant la phase de développement et dans le système nerveux mature5. L’établissement de la connectivité neuronale s’appuie sur la morphogenèse et de la maturation des dendrites. Malformation des dendrites est liée à l’altération de la fonction neuronale. Des études ont montré que l’anomalie de la morphogénèse du neurone da pourrait contribuer aux étiologies de plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH) et la maladie de Gehrig / Sclérose latérale amyotrophique (SLA)6,7,8. Modifications synaptiques apparaissent dans les premiers stades de l’AD, de concert avec le déclin et l’altération de la fonction de neurone7,8. Toutefois, les détails de comment la pathologie dendrite contribue à la pathogenèse de ces maladies neurodégénératives reste insaisissable.
Le développement des dendrites est réglementé par les gènes qui codent pour un réseau complexe d’organismes de réglementation, comme la famille Wnt de ligands sur des récepteurs de surface cellulaire11,12, facteurs de transcription et protéines9,10 . Neurones dopaminergiques Drosophila consistent en quatre classes (classe I, II, III, IV), de quelle classe IV neurones dopaminergiques ont les patrons de ramification plus complexes et ont été employés comme un puissant système expérimental pour mieux comprendre la morphogenèse13, 14. Au cours de la morphogenèse au début, surexpression ou RNAi silencing des gènes dans les neurones dopaminergiques de classe IV provoquer des changements dans les patrons de ramification et dendrite élagage13. Il est important de développer une méthode pratique pour l’analyse quantitative de l’arborisation dendritique neuronale.
Nous avons déjà montré que faire taire des orthologues de drosophile de SOX5, Sox102F, a conduit à plus courts dendrites des neurones dopaminergiques et de complexité réduite en classe IV de neurones da15. Nous présentons ici la procédure d’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile. Ce protocole, adapté de la méthodologie décrite précédente, fournit une méthode brève pour analyser le développement des neurones sensoriels da. Elle illustre l’image robuste à l’étiquetage et le neurone de da dans le troisième stade larvaire paroi corporelle16,17,18,19. C’est un protocole précieux pour les chercheurs qui souhaitent étudier les NDAC et les différences de développement in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les dendrites qui innervent l’épiderme sont les régions d’entrée des neurones et leurs morphologies déterminent comment est reçue et traitée par des neurones individuels. Morphologie dendritique développement reflète la modulation de gène d’organisation de dendrite. La drosophile da larvaire neurone du système nerveux périphérique est un modèle important pour étudier le développement de la dendrite en raison de : 1) la similitude fonctionnelle avec mammifères11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier William A. Eimer pour l’assistance technique d’imagerie. Ce travail a été soutenu par fonds la Cure Alzheimer [à R.E.T], le National Institute of Health [R01AG014713 et R01MH60009 à R.E.T ; R03AR063271 et R15EB019704 à A.L.] et la National Science Foundation [NSF1455613 à A.L.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
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