현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩
1Center for Free Electron Laser Science,DESY, 2Department of Physics,University of Hamburg, 3Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Laboratory for Structural Biology of Infection and Inflammation,University of Hamburg, 4The Hamburg Center for Ultrafast Imaging,University of Hamburg, 5Integrated Biology Infrastructure Life-Science Facility at the European XFEL (XBI), 6European Molecular Biology Laboratory, EMBL c/o DESY, 7Department of Cellular and Molecular Biophysics,Max Planck Institute of Biochemistry
Summary
이 프로토콜은 자세하게에서 조작 상 온에서 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 미세 장치를 작동 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 그것은 동적 산란에 의해 단백질 결정 화를 모니터링 하는 방법 설명 하 고 처리 하 고 분석 하는 방법을 얻은 회절 데이터.
Abstract
이 프로토콜 낮은 x 선 배경 각도 고정된 대상 직렬 결정학을 기반으로 최적화 된 조작 미세 장치를 설명 합니다. 소자는 소프트 리소 그래피를 사용 하 여 에폭시 접착제에서 모방 하 고 실 온에서 x 선 회절 실험 현장에 적합. 샘플 웰 스는 낮은 x 선 배경으로 회절 데이터 수집을 허용 하는 폴리머 polyimide 호 창문이 양쪽에 옛. 이 제조 방법은 요구 하 고 저렴 한입니다. 수-8 마스터 웨이퍼의 소싱 후 모든 제작 일반 연구 랩 환경에서 클린 룸 밖에 서 완료할 수 있습니다. 칩 설계 및 제조 프로토콜 모 세관 valving 정의 nanoliter 크기의 방울으로 수성 반응을 분할 하는 microfluidically를 사용 합니다. 이 로딩 메커니즘 채널 죽은 볼륨에서 샘플 손실 방지 하 고 쉽게 작동 유체에 대 한 펌프 또는 다른 장비를 사용 하지 않고 수동으로 수행할 수 있습니다. 우리는 단백질 해결책의 어떻게 격리 nanoliter 크기의 방울 수 수 모니터링 현장에 동적 빛에 의해 비 산 제어 단백질 크리스탈 nucleation 및 성장에 설명 합니다. 적당 한 결정 성장 후에, 완전 한 x 선 회절 데이터 집합 기반 각도 제자리에 고정 대상 직렬 엑스레이 결정학을 사용 하 여 실 온에서 수집할 수 있습니다. 프로토콜 수정 단백질 결정 구조를 해결 하기 위해 소프트웨어 도구 제품군을 사용 하 여 회절 데이터 집합을 처리 하는 사용자 지정 스크립트를 제공 합니다. 이 이렇게 유물 가능성이 cryo 보전 또는 수동 크리스탈 기존의 결정학 실험에서 처리 하는 동안 유도 방지 합니다. 우리가 제시 하 고 약 10-20 µ m 칩에서의 크기와 작은 결정을 사용 하 여 해결 했다 3 개의 단백질 구조 비교. Crystallizing 고 제자리에서처리 및 따라서 기계 diffracting에 의해 깨지기 쉬운 크리스탈의 소요 최소화 됩니다. 프로토콜에는 제자리에 직렬 결정학에 대 한 적합 한 사용자 지정 x 선 투명 미세 칩을 조작 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 거의 모든 크리스탈 회절 데이터 수집을 위해 사용 될 수 있습니다, 이러한 미세 칩은 매우 효율적인 크리스탈 배달 방법입니다.
Introduction
단백질의 3D 구조를 알고 이해의 기능을 필수적 이다. 근처 원자 해결책 구조 엑스레이 결정학에 의해 지금까지 가장 일반적으로 얻어진 다. 이 기술은 단백질 결정 x 선 방사선에 노출 하 고 결과 회절 패턴은 다음 구조 결정 및 수정에 대 한 분석. 전통적인 엑스레이 결정학, 극저온 온도에서 단일 적으로 큰 크리스탈에서 완전 한 회절 데이터 집합 기록 됩니다. 그러나 이러한 결정, 주로 성장, 하 찮 고 적당 한 곳을 알아내는-보존 조건 식별 하 수 그 자체에 도전 되 고 때때로 또한 네이티브 단백질 구조5에서 편차를 발생할 수 있습니다.
X 선 자유 전자 레이저 (FEL)에 싱크 로트 론 beamlines 최근의 기술 진보는 더 작은 크리스탈 구조를 해결 하기 위해 허용, 새로운 마이크로 초점 beamlines로 증가 x 선 빔 광채, 그리고 향상 된 x 선 검출기 되었다 사용 가능한6,7. 일반적으로, 작은 결정은 보다 큰 성장 하 고 무료 크리스탈8,9제거 하기 쉽습니다. 그러나, 작은 결정 큰 결정 보다 훨씬 더 빠른 x 선 방사선 손상 으로부터 고통. 이 때문에 대형 크리스탈에 비해, 더 높은 엑스레이 복용량 비교 해상도를 diffract에 작은 크리스탈 볼륨으로 예상 해야 합니다. 따라서, 심지어 극저온 보호가 아니다 종종 단일 microcrystal에서 완전 한 회절 데이터 집합을 기록 하는 데 충분 한.
이 장애물을 극복 하기 위해 직렬 결정학 수집 하 고 완전 한 데이터 집합을 얻기 위해 많은 무작위로 지향된 microcrystals에서 회절 패턴을 병합 선택의 방법 되고있다. 방사선 유발된 크리스탈 손상 총 엑스레이 복용량을 확산 하 여 최소화 높은 수 결정5,10의 단백질 구조를 해결 하는 데 사용. 에 ‘ diffract 전에 파괴 ‘ 펠 실험, 각 결정은 femto 초 x-선 펄스를 사용 하 여 하나의 노출에만 사용 됩니다. 제 3 세대 싱크 로트 론 근원에 마이크로 포커스 beamlines 차례로 몇 밀리초 짧은 x 선 노출11,12,,1314직렬 결정학을 수행할 수 있습니다. 그러나 크리스탈 발진 또는 데이터 수집 하는 동안 회전, 없이, 부분 브래그 반사만 기록 될 수 및 따라서 수천 수만 또는 더 많은 회절 패턴은 일반적으로 구조 결정15필요. 날짜 하려면, 다양 한 샘플 전달 방법 최근 검토14,,1617,18,19로 직렬 결정학에 대 한 개발 되었습니다. 그 사이 여러 고정 대상 기반 샘플 배달 되도록 크게 적은 회절 패턴 제공할 수 있는 동등 하 게 완전 한 데이터 집합 또한 더 적은 소모 하는 동안 전략 성공적으로 크리스탈 회전 x 선 노출 동안 결합 했다 샘플에 비해 클래식 직렬 결정학에 스틸 이미지는 실험 기록7,,1620,21,,2223 , 24.
우리는 낮은 x 선 배경으로 미세 장치를 조작 하는 프로토콜을 제시. 장치와 소프트 리소 그래피를 사용 하 여 5 분 에폭시 접착제에서 꽃무늬는 x 선 설정에 직접 통합 하는 경우로 샘플 준비에서 혜택을 실 온에서 제자리에서 x 선 회절 실험에 적합 시간 해결 연구 혼합 유도 속도 론18,19을 따라. 미세 채널은 폴리머 polyimide 호, 낮은 x 선 배경 이미지에 대 한 허용 하는 약 16 µ m의 결합된 두께 가진 x 선 창에서 결과 양쪽 모두 옛. 사용된 하는 모든 자료는 좋은 용 매 저항을 제공합니다. 이 제조 방법은 comparably 간단 하 고 저렴 한입니다. 수-8 마스터 웨이퍼 소싱, 후 모든 제작 일반적인 연구 실험실 설정에서 클린 룸 밖에 서 완료할 수 있습니다.
각도 고정된 대상 직렬 결정학 기반 응용 프로그램 예를 들어, 우리 칩 설명. 첫째, 모 세관 valving microfluidically nanoliter 크기의 방울의 선택한 번호에 수성 반응 분할을 사용 하 여에 대 한 설계 및 제조 고려 사항은 설명 합니다. 이 로딩 방식에서 채널 죽은 볼륨 샘플 손실 방지와 분할 쉽게 수행할 수 있습니다 수동으로 작동 유체에 대 한 펌프 또는 다른 장비를 사용 하지 않고. 단백질 해결책의 이러한 격리 nanoliter 크기의 방울 모니터링 현장에서 제어 단백질 크리스탈 nucleation 및 성장 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 있습니다. 그것은 이전 DL 측정 유리 슬라이드25,26에 보 세입니다 (PDMS) 구조의 구성 된 미세 장치에서 수행할 수 있습니다 입증 되었습니다. 구체의 레이어에 파장 550 이상에 대 한 높은 전송 때문에 nm, 접근 확장 될 수 있습니다 투명 칩에 게 뿐만 아니라, x-선 측정에 적합 한 레이저 파장27,28을 사용 하는 경우. DL 결과에 따라, 초기 nucleation 관찰 될 수 있다, 그리고 더 작은 물방울 증발 적지만 큰 단백질 결정을 얻을 수 수 있습니다.
충분 한 결정 성장 후에, 완전 한 x 선 회절 데이터 집합 다음 실 온에서 각도 기반 제자리에 고정 대상 직렬 엑스레이 결정학을 사용 하 여 수집할 수 있습니다. 회절 데이터 집합 단백질 결정 구조를 해결 하기 위해 일련의 소프트웨어 도구와 사용자 지정 스크립트를 사용 하 여 처리 됩니다. 이 기술은 유물 종종 cryo 보전 기존의 결정학 실험에 사용 되는 동안 유도 방지 합니다.
우리에 대 한 사용 하 여 해결 했다 3 개의 단백질 대상 구조를 비교 하 여 10-20 µ m 작은 결정 더 나은 다음 2 Å 해상도 칩에서 성장. Crystallizing 고 제자리에서처리 및 따라서 기계 diffracting에 의해 깨지기 쉬운 크리스탈의 소요 최소화 됩니다. 이 프로토콜은 낮은 해상도 (1.7 Å 3.0 Å)로 높은 해상도를 diffract는 단백질 결정을 위해 적용할 수 있습니다. 거의 모든 크리스탈 회절에 대 한 사용할 수 있는, 매우 효율적인 크리스탈 전달 방법을 만드는 작은 샘플 낭비 이다.
이 프로토콜 제자리에서 단백질 결정 화 및 회절 데이터 수집에 대 한 x 선 투명 미세 칩을 준비 하는 방법에 대 한 상세한 가이드를 제공 합니다. 절차는 실험실에서 정교한 장비가 필요 없이 미세 정밀 혜택을 신중 하 게 설계 되었다. 또한, 싱크 로트 론 beamline에 데이터 수집 비 전문가가 전문된 각도 또는 쉽게 재현 결과 가습기 필요 없이 수행할 수 있습니다. 제시 기법 크리스탈 또는 곳을 알아내는-보호 처리에 의해 직렬 밀리초 결정학 데이터 수집을 위해 실내 온도에 방사선 손상을 최소화 하면서 고 성장 후 크리스탈을 스트레스 없이 적용할 수 있습니다. 따라서, 설명 방법은 어떤 단백질 결정 화 프로젝트에 적합 합니다.
Protocol
1. 칩 디자인 및 마스터 제작 마스크 디자인 적당 한 CAD 드로잉 프로그램을 사용 하 여 원하는 채널 형상 개요. 각 포토 레지스트 층에 대 한 개별 마스크를 준비 합니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 모든 디자인 결과 섹션에서 자세히 설명 하 고 AutoCad로 사용할 수 있습니다 ‘. DWG’ 보충 파일 1에서 형식.참고: 모든 PDMS 장치를 구축 하기 위한 채널 폭에 높이 종횡비 넘지 말아야 한다 1:10 채널 붕괴를 방지 하기 위해. 폴 호 일 및 경화 에폭시 수 지 sturdier 있으며 원칙적으로 허용 해야 합니다 또한 높은 종횡비. 그러나, 우리가 의도적으로 않았다 초과 하지 1:10 비율, 그래서 그 초기 디자인은 기존의 PDMS 소자로 프로토타입화 수 없습니다. 에멀젼 영화 포토에 CAD 파일을 번역 합니다. 공칭 64 k DPI 해상도 사용 하 여 약 5 µ m 크기로 정확한 기능을 허용 하도록.참고:이 상업 서비스를 통해 수행할 수 있습니다. 이미징 서비스 합리화 마스크 이미지에 대 한 변환 파일을 다른 드로잉 규칙 선호 수 있습니다. 기본 그리기 규칙 미리 변환 하는 동안 촬영 힘 드는 문제를 피하기 위해에 대해 문의 하시기 바랍니다. 검은색에 투명 기능 마스크 SU8 감광 기능 복제 성형 하는 동안 기능 PDMS microchannels를 웨이퍼에 패턴 것 이다. 차례 차례로, 투명 배경 마스크에 검은 기능 PDMS 형 x 선 칩 제조에 적합 한 준비 필요 합니다. 초기 프로토타이핑 및 디자인 유효성 검사 x 선 칩으로 디자인을 변환 하기 전에 PDMS 장치를 조작 수 있도록 마스크 극성 모두를 주문 하는 것이 좋습니다. SU8 마스터 제작참고:이 청정 실에서 수행 해야 하는 유일한 프로세스입니다. 중요 한 클린 룸 장비를 사용할 수 없는 경우 완전 한 단계 준비 꽃무늬 SU8 주인을 제공 하는 MEMS 파운드리 서비스 기업에 아웃소싱 수 있습니다. 프로세스 데이터 시트 지시에 따라 SU8입니다. 1.2.1 1.2.4 단계 일반 SU8 마스터 제작 워크플로, 표 1에 나열 된 3 층 x 선 칩 디자인에 대 한 완전 한 매개 변수 요약. 다층 SU8 정렬 되었습니다 소개29이전 게시. 부 SU8의 대략 1 개 mL 3 인치 웨이퍼와 스핀 코트에 표 1 (그림 1, 단계 1)에 지정 된 대로 적절 한 회전 속도 시간을 사용 하 여 원하는 두께까지 SU8 저항. 몇 분 동안 65 ° C에서 95 ° C 레이어 두께 따라 감광 제를 미리 구워. SU8는 포토 마스크에 집착 하는 그것을 방지 하 고 저항 (그림 1, 2 단계) 기판에 접착을 개선 강화 하기 위해 전 빵을 수행 합니다. 표 1 뒤에 후-exposure-빵 95 ° C에 촉매로 노출 (그림 1, 3 단계) 동안 시작 된 photoreaction를 완료 하는 데에 지정 된 대로-자외선에 감광 제를 노출 합니다. 각 후속 레이어에 대해이 단계를 반복 합니다. 다음 후속 레이어의 포토 마스크 aligner와 버 니 어 캘리퍼스 정렬 마크29를 사용 하 여 마스터 맞춥니다. 씻어 모든 노출 되지 않은 SU8이 소 프로 파 놀 rinsing 이상 밝혀 밀키 강수량 (그림 1, 4 단계) 될 때까지 프로필 렌 글리콜 메 틸 에테르 아세테이트 (PGMEA), 웨이퍼를 개발 하 여 저항. 고압된 질소를 가진 웨이퍼 건조.참고: 소 프로 파 놀 SU8에 대 한 불 쌍 한 용 매 이며 그것의 강 수 잔여 uncured 남아 나타냅니다. PDMS 몰드 제작 페 트리 접시 (10 cm)에 알루미늄 호 일 (15 × 15 cm)의 조각을 놓고 PDMS 경화 후 마스터의 쉬운 제거를 위한 페 트리 접시에 알루미늄 호 일에 SU8 마스터를 배치 합니다. 믹스 기본 실리콘 경화 에이전트 (10:1), 항아리에 주걱으로 적극적으로 25 g, 총 양의 결과 또는 기계 믹서. 페 트리 접시 (10 cm)에 3 인치 웨이퍼 슬 래 브 두께 5 m m에서에서 결과 PDMS의 약 25 g를 사용 합니다. 아니까지-기포를 제거 하는 SU8-마스터 (그림 1, 5 단계) 높이 4 m m. Desiccate 5 분에 대 한 PDMS에 미리 혼합된 PDMS를 부 어 또는 단지 몇 가지 거품 PDMS 표면에 남아. 오븐에서 1 h 동안 70 ° C에서 PDMS를 치료. 다음 메스로 치료 PDMS를 잘라 하 고 부드럽게 SU8 마스터 (그림 1, 6 단계)에서 PDMS 몰드를 껍질. 필 링 동안 PDMS 균열을 방지 하기 위해 마스터까지 잘라. 옵션: 모든 SU8-레이어 마스터에 원하는 두께 (그림 1)을 확인 하는 PDMS 금형의 횡단면 조각을 준비 합니다. 초 미세 채널 레이아웃 테스트 하는 것은 모든 PDMS 칩에서 수행할 수 있습니다.참고: 복제 성형 PDMS 수 수 보 세 유리 기판에 직접 액세스 포트 (단계 3.3) O2 플라즈마 활성화 20를 사용 하 여 통해 PDMS에 구멍을 뚫는 후 s, 0.4 mbar O2, 50 W, 13.56 m h z. 섹션 1.2에서 설명한 것 처럼.,이 반대 극성을 마스크 하 고 따라서 x 선 칩 제조에 대 한 개요를 웨이퍼 필요 합니다. 2. 선 칩 제조 현장에 둘 다 에폭시 수 지 전 40 wt %의 에탄올 최종 농도에 에탄올에 희석. 에탄올에 각 에폭시 수 지 전조의 0.25 g의 총 질량은 한 1 cm2 칩에 대 한 충분 한.참고:이 혼합 거품 무료 및 복제 몰드 캐스팅, 단순화 하 고 최종 경화 에폭시 층의 두께 최소화 하기 위해 결과 5 분 에폭시의 점도 감소 시킨다. 에탄올 경화 단계는 PDMS 통해 증발. 드가 작은 공기를 흡수할 수 있도록 30 분 동안 진공 desiccator에는 PDMS 몰드 성형 단계에서 에폭시 수 지에서 거품. 약 70 × 70 m m와 스팬 주위 75 × 50 mm 평평 하 고 딱딱한 표면 뒷면에 테이프를 테이프를 사용 하 여 슬라이드 유리에 폴 호 일을 잘라. 플라즈마 50 W, 13.56 m h z 20 0.4 mbar O2 플라즈마 포 일 활성화 s, 1 vol % (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTS) 또는 20 ° c.에서 5 분 동안 (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS)의 수성 해결책에 있는 완전 한 일 슬라이드를 품 어 철저 하 게 최적의 경화 동작이 되도록 에탄올 희석 에폭시 전조 솔루션을 모두 섞는다. 진공 약 실에서 PDMS 몰드를 검색 하 고 평평한 표면에 놓습니다. 다음 신속 하 게 분배 micropipette (마이크로 구조의 1 c m2 당 약 10 µ L)를 사용 하 여 금형에 각 미세에 혼합된 수 지의 물방울 (그림 1, 단계 7a). 폴 포 일 슬라이드 샌드위치 수성 silane (APTS 또는 GTPS) 솔루션에서 검색 합니다. 건조 한 압축된 공기 또는 질소를 포 일. 예금 된 에폭시 수 지 (그림 1, 단계 7b)에 준비 된 구체의 호-유리-슬라이드 샌드위치를 놓습니다. 단단히 PDMS 몰드에 대 한 폴 포에 부착 된 유리 슬라이드를 누릅니다. 금속 시트 유리 슬라이드와 다음 실 온에서 에폭시 수 지 치료 하는 동안 1 시간에 대 한 최대 1.4 N/c m2 압력 예금 무게에 배치 합니다.참고: 이상적으로, 아니 수 지는 금형에서 구조 최대한 높이 지역에 호 일에 남아 있습니다. 이 결정 체가 이루어지는 이후에 결정 화 웰 스에 해당 합니다. 선택 사항: 작은 기능의 정확한 성형 PDMS 몰드 성형 동안 알루미늄 프레임 강화 될 수 있는 중요 한 경우31단계. PDMS 몰드 (그림 1 단계 8)에서 필 링으로 폴 포와 무늬 에폭시 유리 슬라이드를 제거 합니다. 플라즈마 활성화 20 50 W, 13.56 m h z, 0.4 mbar O2 플라즈마 무늬 에폭시 측면 s. 플라즈마 챔버에서 폴 호 일 제거 후 에폭시 꽃무늬 포 일 1 vol % 수성 APTS (또는 GPTS) 솔루션에 20 ° c.에서 5 분을 품 어 마찬가지로, 보완 1 vol %GPTS (APTS) 실 활성화 된 두 번째 해제 패턴된 폴 호 일을 준비 합니다. 부 화 후 구조화 및 구조화 되지 않은 호 가압 공기 건조. 에폭시 측면 얼굴을을 포 일의 컬링 방지 하 고 최대한 평탄도 보장 하기 위해 중재자 아래 물 한 방울의 표면 장력을 사용 하 여 평평한 표면에 놓습니다. 다음 위쪽 및 부드럽게 한 모퉁이에서 유대 그들와 거품의 형성을 피하기 위해 반대 손가락으로 행진에 두 번째 활성화 된 구체의 호 일을 놓습니다. 3. 액세스 포트 유체 배달에 대 한 SU8-마스터를 사용 하지 않고 4 m m 단계 1.3.1 1.3.3 따라 페 트리 접시에 두꺼운 PDMS 석판을 준비 합니다. PDMS는 칩의 개별 결정 화 구획을 취재 하지 않고는 칩에 모든 입구 포트를 적절 한 크기의 블록으로 석판을 잘라. 플라즈마 활성화 둘 다, 칩과는 PDMS 블록 50 W, 13.56 m h z, 0.4 mbar O2 플라즈마 20 s. 화학 결합에 대 한 다음 각 부분 1 vol % 수성 APTS 또는 GPTS 솔루션에 20 ° c.에서 5 분 동안 품 어 각 부분 가압 공기를 건조 하 고 호 일 칩 위에 PDMS 슬 래 브를 누릅니다. 를 개선 하기 위해 결합 플랫 PDMS 슬 래 브에 칩을 놓고 깨끗 한 유리 슬라이드와 금속 블록, 플라스틱 호 일 커버. 마지막으로, 입금 최대 1.4 N/c m2 압력 약 1 시간에 대 한 무게. 접근 구멍 입구 및 출구 포트 칩 디자인에 표시 됩니다 하 고 밀봉 테이프로 다시 각 위치에서 0.75 m m 생 검 펀치와 펀치. 칩은 지금 (으로 단계 4.2에서에서) 구멍의 직경 일치 하는 외부 직경으로 모든 배관에 대 한 접근. 4. 표면 처리 1시 20분 준비 9 wt % 플라스틱 주식 0.45 wt %의 최종 농도에 불 화 용 매에 희석. 재고 솔루션 및 희석 4 ° c.에 어둠 속에서 냉장고에 저장 1시 20분 로드 1 mL Luer 잠금 주사기에 약품 희석. 첨부 27G × 5/8″바늘 주사기와 바늘을 PTFE 튜빙. X 선 칩 콘센트에 튜브를 연결 하 고 주입 플라스틱 작업 솔루션 단계 4.1에서에서 준비 하는 모든 채널 채워질 때까지. 190 ° C 뜨거운 접시는 플라스틱 박막 코팅을 입금 하는 모든 용 매를 증발을 5 분에 내려 편평한 측으로 칩을 놓습니다.참고: 새로운 geometry를 사용 하 여 때로이 코팅 과정 플라스틱으로 막힌 했다 확인 하십시오. 그렇다면, 추가 재고 솔루션을 희석. 5. 단백질 준비 동결 건조 된 thaumatin의 무게와 40 mg mL-1의 최종 단백질 농도 얻기 위해 적절 한 볼륨을 표 2 에 나열 된 버퍼 솔루션에 용 해. 포도 당 isomerase 제조 업체 프로토콜에 따라 표 2 에 나열 된 버퍼에 대 한 dialyze 앞에서 설명한 슈베르트 외 여러분 에 의해 단백질 thioredoxin 준비 30. Photometrically 표 2, ProtParam32소프트웨어에 의해 계산 요약 소멸 계수를 사용 하 여 최종 단백질 농도를 확인 합니다. 초순 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 하 고 0.2 µ m 필터 필터링 합니다. 16100 x g에서 15 분 동안 20 ° C에서 단백질 솔루션 원심 고 결정 화 실험에 대 한 상쾌한. 6. 단백질 결정 화 x 선 칩 미세 칩에 단백질을 구체화, 단백질 솔루션 precipitant 솔루션의 동등한 양으로 혼합 한다. 단백질 농도, 버퍼 구성 및 precipitant 구성 표 2에 요약 되어 있습니다. 미세 칩을 채우기 위해 약 20 µ L의 총 볼륨을 준비 합니다. 솔루션 투입 즉시 혼합 후, 주사기를 통해 칩의 입구 포트에 27G × 5/8 “바늘 및 PTFE 튜브와 결합 0.75 m m 외부 직경 (4.2 단계에 자세히 설명).참고: 직렬 레이아웃 작성 절차 쉬운 입구 포트를 통해 결정 화 해결책을 주입 하기 전에 불 오일 출구 포트에서 로드 하 여 이루어집니다 불 기름으로 칩의 이전 못쓰게를 필요 합니다. 로딩 단계를 모두 모니터링 해야 합니다 수 적용 된 주사기 압력 및 해당 유량을 제어 하는 현미경을 사용 하 여. ” 칩은 가득 후, 칩의 입구 포트 불 오일 주입 하 여 개별 결정 화 구획을 구분 합니다. 칩의 모든 입구와 출구 포트를 차단 하 여 칩을 봉인. 이 클립을 삽입 하 여 수행할 수 있습니다.참고: 때문에 결정 화 구획 단백질/비례적 솔루션에 의해 채워진다, 불 기름만 채운다는 칩의 입구 채널 결정 화 구획에서 솔루션에 영향을 주지 않고. 증기 확산 결정 화 속도 론을 모방, 주위 온도 폴 포 일을 통해 물의 증발에 의해 축소 화 구획에 물방울을 허용 하도록 정상적인 분위기에서 봉인 된 칩을 배치 합니다. 크리스탈 후 형성은 현미경을 통해 관찰 또는 DL 측정 (7 단계), x 선 회절까지 증발 결정 화 웰 스에서 추가 중지 적절 한 precipitant 솔루션으로 완전 한 미세 칩 전송 실험 수행 됩니다. 7. 동적 빛 칩 웰 스 화 측정을 비 산 참고: DL 측정에 100의 레이저 출력 전력으로 수행한 mW, 파장 660 nm와 흩어져 빛 142 °의 산란 각도에서 검색 되었습니다. 모든 조사 샘플 솔루션 수성 때문에 물의 굴절률 (n = 1.33) 모든 계산에 사용 되었다. 장소는 미세 칩에 8.1 단계에서 설명 하는 어댑터를 사용 하 여 DL 악기의 SBS 형식 플레이트 소유자에서. 장치에 어댑터를 삽입 합니다. 신중 하 게는 자동화 한 x, y, z-단계를 사용 하 여 미세 칩의 구획 안에 레이저 초점을 조정 합니다. 매우 얇은 미세 칩 이므로 작은 증분 단계를 적용 하 여 z 레벨을 조정 합니다.참고: 올바른 조정 높은 인터셉트와 DL 측정의 결과 자기 상관 함수의 부드러운 꼬리에 의해 확인 된다. 교정 파일 여러 구획에 자동된 DL 측정 시간이 지남에 수 있도록 미세 칩에서 각 개별 결정의 위치에 맞게 만들 수 있습니다. 30 s 및 반복 293 K에서 각 DL 측정 수행 결정 화 실험의 끝까지 5 분 마다 측정.참고: 초기 nucleation 지켜질 수 있다 시간이 지남에 DL 측정의 radius 유통 하 고 성공적인 크리스탈 형성 지켜질 수 있다 동시에 DL 플레이트 리더의 내장 현미경에 의해. 8. 회절 데이터 수집 Beamline goniometers에 대 한 어댑터 위치 및 결정학 데이터 수집 중 x 선 칩을 회전 접시 각도 대 한 어댑터를 인쇄 합니다. 취미-학년 3D 프린터 제조업체에서 권장 하는 대로 기본 매개 변수 설정을 사용 하 여 기본 각도 대 한 어댑터를 조작.참고: 어댑터는 3D CAD 시스템을 사용 하 여 설계 되었습니다 그리고는 어댑터의 좌표 파일에 연결 ‘. STL’-보충에서 파일 형식. 이중 양면된 테이프를 사용 하 여 어댑터를 x 선 칩 수정 합니다. x 선 결정학 제자리에 296 K. 사용 엑스레이 12.8의 에너지에서 10 × 5 µ m (가우스 프로필의 FWHM)의 빔 크기를 사용 하 여 회절 데이터 수집 케빈과 2.2 ·의 플럭스 1011 광자 · 감쇠 빔 Pilatus 6 M 하이브리드 픽셀 검출기를 사용 하 여 레코드 회절 패턴에서 s-1참고: thaumatin를 포함 하는 미세 장치, 포도 당 isomerase 또는 thioredoxin 크리스탈 사용 됩니다 제자리에서 x 선 결정학에 실험의 페트라 III 싱크 로트 론 EMBL beamline P14. 사용할 수 있는 빔 초점 크기와 플럭스 다른 엑스레이 근원에서 달라질 수 있습니다. 노출 된 단백질 결정, 각 결정, 노출, 당 진동 각도 범위와 노출 시간에서 기록 된 회절 패턴의 수 수는 표 3에 요약 되어 있습니다. 프로세스는 개별적으로 프로그램 XDS33를 사용 하 여 두 개의 연속 된 회절 패턴의 설정 합니다. “Xds.sh”는 보충 자료에 나와 bash 스크립트를 사용 합니다. 모든 결정에서 각 데이터 집합에 대 한 HKL 파일을 만들고 소프트웨어 XSCALE33를 사용 하 여 확장 합니다. 보충에서 bash 스크립트 “xscale.sh”를 사용 하 여 XSCALE에 대 한 입력된 파일을 만듭니다.참고: 동형의 고차를 나타내는 90% 보다 큰 상관 계수는 결정의 집합만 조절 한다. 보수적인 기준 ‹I/σ (I) › (> 2) 높은 해상도 껍질을 결정 하는 데 사용 한다. MOLREP34 CCP4 스위트35 에서 프로그램을 사용 하 여 분자 교체의 단백질 데이터 은행 (PDB) 표 3에 표시 된 3 차원 좌표를 사용 하 여 건물 추가 모델에 대 한 단계를 사용할 수 있습니다. Isotopically Refmac535,36 을 사용 하 여 모든 구조를 수정 하 고 최종 모델의 시각적 검사 쿳37 사용 합니다.참고: 용 매 분자 구체화 프로세스 동안 자동으로 추가 되어야 합니다 그리고 화학적으로 적당 한 위치를 확인 하려면 확인 해야 합니다. 모든 모델 야 Ramachandran outliers 식별을 검사 해야 합니다. 9. 데이터 평가 방사선 손상 오 웬 외38에 의해 설명 하는 방법을 사용 하 여 시간이 지남에 따라 회절 권력의 부패를 분석 합니다. 이 위해, 각 평가 회절 데이터 집합의 (2 연속 회절 패턴), 참조 값으로 사용 하는 모든 인덱싱된 반사의 I/σ(I) (XDS33제공)의 총 합계를 계산 합니다. 보충에서 bash 스크립트 “ISigma.sh”를 사용 합니다. 첫 번째 데이터 집합의 평균 회절 힘에 각 데이터 집합의 회절 힘을 정상화. XDS33 (bash 스크립트 “Rmeas.sh”는 보충에서)에서 가져온 Correct.LP 파일에서 Rmeas 값을 취 함으로써 시간이 지남에 Rmeas 값의 변화를 분석 합니다. 크리스탈 오리엔테이션 오일러 각도 실험실 좌표계에 결정 격자 방향 분포에 대 한 정보를 확인 합니다. XPARM39 Matlab 소프트웨어를 사용 하 여 출력 파일에 지정 된 XDS 방향 매트릭스에서 오일러 각도 계산 합니다. Bash 스크립트 “rotation_matrix.sh”를 사용 하 여 XPARM 파일에서 각 크리스털에서 회전 매트릭스를 추출. Matlab에 대 한 입력으로 출력 파일을 사용 하 여 Matlab 함수 rotro2eu.m (보조 파일)를 사용 하 여 오일러 각도를 계산.참고: 계산의 자세한 내용은 Zarrine Afsar 외40에 의해 게시 되었습니다. 도를 라디안에서 얻은 오일러 각도 변환 합니다. 모든 3 개의 회전 비행기 (xy, xz zy) 10 °의 클래스에 대 한 획득된 오일러 각도 그룹화 하 고 Origin9 소프트웨어를 사용 하 여 플롯.
Representative Results
에폭시는 x 선 칩 제조를 위한 우수한 충전 물 물자 이다. 그것은 저렴, 간단 하 고 강력한 프로세스에 필요한 전문된 도구 (그림 1) 없이입니다. 과잉 수 지 화 잘 위에 정의 된 x 선 창에서 결과의 제거를 촉진 40 wt % 에탄올과 그것을 diluting 하 여 에폭시의 점도 감소. 높은 에탄올 희석 결함 경화 수 지에 결과. X 선 칩 횡단면 분석 하 여 우리는 2 × 7.5 µ m (그림 2)의 사용된 폴 포의 공칭 두께 매우 가깝습니다 수 약 19 µ m 두께, 양쪽 모두의 총 창 두께 결정 결정 화 실험41위에서 설명한 대로 모 세관 밸브 메커니즘을 사용 하 여 여러 크기의 nanoliter 반응 구획 각각으로 고립 되었다. 이 ‘가 그때 만들기 ‘ 로딩 기술 채널 죽은 볼륨에서 샘플 손실 방지 하 고 쉽게 수행할 수 있습니다 수동으로 펌프 또는 다른 장비를 사용 하 여 유체 작동기42에 대 한 필요가 없습니다. 칩은 수성 샘플을 로드 하기 전에 불 기름으로 끝났다. 못쓰게 기름과 인터페이스를 통해 압력 차이에 수성 샘플 결과 사이 기름-물 인터페이스에서 표면 긴장. 이 라플라스 압력 곡률 반경 및 인터페이스의 표면 장력에 따라 달라 집니다. 그것의 에너지를 최소화 하기 위해 인터페이스의 주요 일정 볼륨에서 곡률 반지름을 극대화에 표면을 최소화 해야 합니다. 넓은 채널에 낮은 곡률 인터페이스는 낮은 라플라스 압력 다음 좁은 수로 세그먼트에 높은 곡률 인터페이스. 따라서, 샘플 플러그 우선적으로 입력 하 고 넓은 통해 흐름 우회 좁은 모 세관 밸브 제한을 통해 흐르는 대신 채널. 마지막으로, 샘플 플러그 독립적인 작은 물방울으로 샘플 우물을 불 기름에 선행 된다. 강력 하 고 신뢰할 수 있는 로드, 직렬 및 병렬 잘 배열 (그림 3) 1 mL/h 최대의 흐름 율을 가진 달성 했다. ‘직렬’ 레이아웃에서 잘 입구 및 모 세관 밸브 constrictions 바이패스 채널31를 통해 순차적으로 연결 됩니다. 반면, ‘병렬’ 레이아웃에서 두 개의 별도 주요 채널 연결 모든 잘 후미 또는 모 세관 밸브만43. 두 배열 개념 이전 화면 구성, 단백질 결정 화43,44에 유용한 측면을 배합 제어와 결합 되었습니다. 직렬 디자인은 두 개의 유체 포트, 1 개의 입구 및 1 개의 출구 다. 그것은 더 적은 액체의 포트가 이며이 간단 하 게. 병렬 레이아웃 4 유체 포트, 우물을 연결 하는 주요 채널 2와 공기 나 초과 석유 탈출 모 세관 밸브를 연결 하기 위한 2는 있습니다. 로드는 주요 채널 양측에서 따라서 진행할 수 있습니다. 이 레이아웃은 전반적인 흐름 저항 때문에 그것의 짧은 우회 우물의 동등한 수에 대 한 낮은. 그것은 따라서 더 적합 우물의 높은 수 위로 조정 장치에 대 한. 또한, 샘플 우물이 가까이 함께 지향, 어떤 장점이 이미징 자동화에 대 한. 중 2-높이 또는 3 높이 디자인으로 건축 하는 경우 전체 샘플 잘 로드 두 레이아웃에 대 한 관찰 되었다. 2-높이 디자인 잘 샘플 및 바이패스 채널 모두에 동일한 높이의. 3 높이 디자인 필요 3 마스크, 추가적인 SU8 및 샘플 웰 스가 이전 보다 더 높은 추가 되도록 정렬 단계 우회 채널. 이 높이 차동 촉진 샘플 액체의 흐름에 constrictions에서 중지 원리 valving 같은 모 세관을 통해 잘에 입력 합니다. 여기, 더 높은 잘 천장 낮은 우물 가득 완전히 밸브 constrictions 흐름을 차단 하 고 우회 아래로 전환 되도록 후 전진 초승달 모양 및 바이패스 방향 따라 흐름의 라플라스 압력만 선호에 해당 합니다. 그러나, 성공적인 로드로 적절 한 모 세관 valving 또한 달성 될 수 있다 채널 폭을 적절 하 게 조정 하 여 우회 보다 높은 웰 스를 엄격 하 게 필요 하지 않습니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 경험에 높은 웰 스 수행 크게 더 강력 하 고 결함 무료 로드 모든 3 높이 디자인에서 더 높은 유량 상응 하는 2-높이에 비해 최대 10 배에서 관찰 되었다 키를 누릅니다. 이 효과 병렬 레이아웃에 더 발음 했다. 증기 확산 결정 화 속도 론을 모방, 구체의 호 유한 침투성 시간이 지남에 물 증발 제어 하 악용 했다. 실험적 증발 속도 드롭 표면적과 잘 높이 (그림 4C)를 동일시 하 여 시간이 지남에 따라 물방울 볼륨의 변화를 모니터링 하 여 정량 했다. X-레이 칩에 결정 화 우물에서 증발 시간45감소 증발 속도 용 질 농도 결과 증가 드롭의 축소 면적으로 선형 패션에서 진행 되지 않습니다. 초기 증발에 따라 직렬 레이아웃 기하학의 우물에서 0.5 nL h-1 에 대 한의 약 선형 속도. 이해 하 고 더 나은 결정 화 속도 론, DL 측정 미세 칩의 결정 화 웰 스에서 수행 했다. 초기 DL 측정에 대 한 PDMS 칩 유리 슬라이드에 보 세 산란 실험에 대 한 더 나은 광학 속성을 제공 하기 위해 사용 되었다. 이 칩을 x 선 칩으로 동일한 잘 크기 했다. PDMS는 x 선 칩45구체의 창의 폴 보다 더 높은 수증기 침투성. 사용자가 자 속 선형 거리 확장, 이후 창 폴의 증발 궤도 잘 적절 한 두께의 해당 PDMS 창 일치할 수 있습니다. DLS 결과 radius 배포 시간에 따라 변화 (그림 4A-B), DL 측정 첫 번째 결정 입자 관찰 하기 전에 초기 nucleation 검색 허용을 보여주는 표시 됩니다. 외부에서 증발 속도 조정 하 여 잘 당 단일 결정의 성장과 nucleate이 정보를 사용할 수 있습니다 및 따라서과 포화 nucleation46의 초기 단계에서 수준. X 선 칩의 페트라 III (그림 5A)에 싱크 로트 론 P14 EMBL beamline에 SBS 호환 판 각도 대 한 3 차원 인쇄 어댑터에 고정 되었다. 또는, 작은 3D 인쇄 프레임 표준 beamline goniometers21x 선 탑재 칩을 사용할 수 있습니다. Thaumatin 크리스탈 10-20 µ m (그림 5B)의 크기와 2.0의 해상도 diffract Å (그림 5C). 예상 대로 두 개의 얇은 폴 포 창 x 선 칩에서의 x 선 배경 기여 11 Å에 구체의 폴리머 분산 반지로 제한 됩니다 (2θ ~ 5 °) 및 33 Å (2θ ~ 1.7 °) 0.97 Å의 x 선 파장에 대 한. 이 두 개의 링 데이터 처리 방해 하지 마십시오. 총 데이터 집합 83 thaumatin 결정을 수집 하 고 10 회절 패턴은 각 프레임 동안 1 ° 회전 각 결정에서 기록 되었다. Thaumatin 데이터 집합의 통계 뿐 아니라 데이터 처리 및 수정 매개 변수를 나열 되며 두 개의 다른 데이터 집합 포도 isomerase의 thioredoxin 했다 또한 표 3 및 에 나열 됩니다 수집 제자리에 비해 표 4. 5 하위 데이터 집합에 thaumatin 데이터 집합을 분할 하 여 시간이 지남에 따라 정규화 된 회절 힘의 강도 부패 조사 (두 개의 회절 패턴 사용 되었다 하위 집합 당 완전 한 데이터 집합을 유지 하기 위해). 그림 6B같이 회절 전원 첫 번째 하위 데이터 집합 후 감소 하기 시작 했다 그리고 4 하위 데이터 집합에 50% 미만 했다. 결과적으로, 하위 데이터 집합의 Rmeas 값 또한이 데이터 수집 중 x 선 방사선 피해를 나타내는 시간이 늘고 있다. 우리는 자유 래 디 칼 x 선 노출 시 신속 하 게 생성 저하 같은 반응 구획에 인접 결정 가설. 예를 들어 이러한 2 차 x 선 손상이 했다 덜 관련된 실험 방법에서 발음 어디 크리스탈 구체의 샌드위치21에 상당히 큰 지역에 배포 되었습니다. 전반적인 x 선 피해를 최소화 하기 위해 특정 결정에서 회절 패턴 수가 적은 실 온에서 수집 한다. 또한, 하나의 단일 단백질 크리스탈 미세 칩의 당 노출 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 처리 된 데이터 집합을 사용 하 여 세련 된 모든 구조 모델 보여 매우 좋은 입체 화학 및 적합 한 통계 (표 4). 또한, 모든 최종 전자 밀도 지도 아주 좋은 품질의 했다. X 선 투명 칩에 이전 결정학 접근, 방향 및 결정의 크리스탈 방향40 의 무작위 분포를 얻기 위해 의도적으로 조작 했다 또는 크리스탈 움직임에 의해 얻은 액체 층21내. 이 프로토콜에서 설명 하는 x 선 투명 미세 칩의 크리스탈 방향을 평가 하는 실험실 좌표계에 관하여 모든 노출된 결정의 단위 세포 방향이 결정 했다. Bipyramidal thaumatin 결정에 대 한 약간의 기본 설정 우리가 얻은 포도 당 isomerase 결정 (그림 7B)에 대 한 광범위 한 배포 하는 동안 (그림 7A), 관찰 되었다. 우리는 나노미터 가늠 자에 대부분의 자료 전시 상당한 거칠기 권유. 따라서, 결정 수 저절로 nucleate 상당히 적은 편 파 방향에서 표면에 자발적으로. 이러한 작은 크리스탈 핵 표면 정상에 상대적인 reorienting 없이 적절 한 크기로 성장 하면서 한 방향으로 잠겨있을 수 있습니다. 사실, 표면 중재 크리스탈 nucleation crystallographers 과정에서 크리스탈을 손상 하지 않고 표면에서 연결 된 크리스탈을 루프 하 게 성가신 되었습니다 오래. 여기, 우리가 직접 회절 데이터 컬렉션에 대 한 같은 결정을 활용할 수 있습니다. 그러나, 시스템 특정 제한 존재, thioredoxin는 계시는 xy, xz-및 yz-평면 (그림 ℃)에서 특정 방향에 대 한 강한 선호 합니다. 보여준 예는 크리스탈 모양에 뿐만 아니라 성장 환경에 방향 분포만 의존 하지 않는 그를 보여 줍니다. Thioredoxin 크리스탈 모양을 정방 bipyramidal thaumatin 결정 또는 orthorhombic 포도 isomerase 결정이이 동작을 표시 하지 않습니다 있지만 원하는 방향에서 성장 하는 경향이 늘어난다 있다. 그러나, 모든 경우에도 크리스탈 회전의 접근 범위 귀착되 었 다 충분히 좋은 보험 상호 공간 및 따라서 완전 한 데이터 집합의 모든에 대 한 기본 방향으로 조사 단백질. 따라서, 아무 추가 조치 엑스레이 노출에 대 한 결정을 선택할 때 이동 했다. 그림 1 : 미세 x 선 칩 제조의 계획. (1) 수-8은 실리콘 기판 및 원하는 레이어 두께를 코팅 하는 스핀에 적절. (2) 포토 레지스트 마스크를 통해 UV 방사선에 노출 됩니다. (3) 노출 되지 않은 포토 레지스트 PGMEA와 소 프로 파 놀 연속적으로 세척 하 여 멀리 개발 다음, (4) 결과 추가 캐스팅에 대 한 수호-8 마스터 단계. (5) PDMS, 부 수 8 마스터에서 벗 겨 (6) 후 치료 PDMS 몰드 및. (7a) 에폭시 접착제 PDMS 몰드에 적절 하 게 (7b)는 활성화 된 구체의 호 일은 화학적으로 에폭시 수 지에 접착. (8), 경화 후 무늬 얇은 에폭시 필름으로 폴 포 일은 PDMS 몰드에서 벗 겨. (9) 마지막 단계에서에서 장치를 동봉 된 낮은 x 선 배경 미세 칩을 두 번째 구체의 호 옛입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 사진 (왼쪽) 및 최종 칩의 횡단면의 현미경 이미지. 대표 채널 세그먼트 (가운데)와 결정 화 (오른쪽) 두 개의 별도 칩에서 잘 표시 됩니다. 화살표는 측정된 거리를 나타냅니다. 모든 차원은 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : 결정의 회로도 병렬 또는 직렬 레이아웃 [B] [A]와 µ m에 표시 된 크기와 상단 및 측면에서 볼 때 잘 디자인. 전형적인 채널 고소 했다: 50 µ m 우회, 50-60 µ m 결정 화 잘, 5-10 µ m 모 세관 밸브, 약 2.5의 볼륨을 잘 해당 nL (병렬 레이아웃)와 8 nL (직렬 레이아웃). 잘 동작을 로드 하는 대표 음식 염료를 사용 하 여 표시 됩니다. 칩은 음식 염료 스토리지 우물에 주입 했다 전에 12 wt %1 H, 1 H, 2 시간, 2 시간-퍼플-1-octanol FC-43, 끝났다. 흰색 화살표는 흐름의 방향을 나타냅니다. 모든 우물 로드 로드 장치 쇼의 개요 이미지 무료, 보여주는 강력한 샘플 로딩 제거. 직렬 레이아웃 웰 스와 2-높이 디자인으로 묘사 된다 동등한 높이 데 무시 하는 동안 병렬 레이아웃 3 높이 디자인, 바이패스, 보다 높은 결정 화 우물으로 보여 줍니다. 전형적인 유량 로드, 하는 동안 약 150 µ L/h 하지만 결함 무료 로드 flowrates 3 높이 디자인에 최대 1 mL/h의에 대 한 관찰 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 잘 시간이 지남에 결정의 동적 빛 산란 제자리에 . [잘 결정의 A] 미세한 이미지 시리즈. 연속 저장된 방울 시간이 지남에 수증기 증발로 축소 합니다. 첫 번째 thaumatin microcrystals 4 h. [B] [A]에서 촬영 하는 동일한 결정 화 과정 DL로 측정 하는 thaumatin 입자의 대응 유체역학 반경 배포 후 관찰할 수 있습니다. 약 1-2 헤 [C] 대표적인 볼륨 후 초기 nucleation 이벤트를 볼 수 있습니다 나타내는 두 번째 radius 분수의 형성 시간이 지남에 증발 물 손실로 인해 두 참조 물방울 볼륨의 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 회절 데이터 수집 제자리에 . [A] 개별 미세 칩에 접시 각도 3D 인쇄 어댑터 (파란색)에 의해 거치 된다. [B] Thaumatin는 미세 결정으로 beamline P14에서 인라인 현미경에 의해 몇 군데 x 선 노출 시 칩. [C] thaumatin 크리스탈의 회절 2.0의 해상도로 기록 된 Å, 사소 하 게 낮은 배경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 : 실내 온도에 미세 칩에 thaumatin 결정에서 회절 데이터의 데이터 평가 기록. [A] 전자 밀도 1-2 데이터 집합만 (파란색 윤곽선에서 1.5 σ)는 프레임을 사용 하 여 세련 된 thaumatin 모델입니다. [Thaumatin 크리스탈의 B] 강도 부패 엑스레이 복용량의 기능으로 [C] 엑스레이 복용량 이상 Rmeas 값의 진화. 박스 플롯 [b]와 [C] quartiles (위 값 75% 중간 값 50%, 낮은 값 25%, 평균)와 95% 수염 자신감을 간격 대표 회절 강도의 부패와 모든 노출된 결정의 Rmeas (n = 83). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 7 : 실험실 좌표계에 관하여 미세 칩 호 일에 단위 셀 방향 분포. [A] bipyramidal thaumatin 결정 방향이 거의 180 °에 xy-(블루), xz-평면 (그린) yz-(red) 비행기를 다루는 광범위 한 분포를 보였다. [B] 포도 당 isomerase 동안 [C] thioredoxin 보여준 강한 기본 설정 특정 방향 또한 광범위 한 배포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. SU8-레이어 스핀 코트 전 빵 노출 후 빵 [65 / 95 ° C] [65 / 95 ° C] 1세인트 레이어: 웰 스 1000 RPM 0 / 10 분 200 mJ/cm2 1 / 4 분 15 µ m SU8-3010 2차 계층: 바이패스 2000 RPM 0 / 16 분 220 mJ / cm2 1 / 5 분 35 µ m SU8-3025 3rd 레이어: 밸브 3000 RPM 0 / 3 분 150 mJ / cm2 1 / 2 분 5 µ m SU8-3005 표 1: 3-레이어 병렬 x-레이 칩 설계를 위한 SU8 프로세스 예제. 이 레이어 순서 x 선 칩 제조에 대 한 PDMS 몰드를 주조에 대 한 수 있습니다. 직접 곰 팡이 PDMS 프로토타입 중, 1세인트 레이어 대신 마무리 3rd 에서 시작 마스터 제작 중 주문 레이어를 반전. 단백질 단백질 농도 단백질 버퍼 precipitant 공간 그룹, PDB 항목 소 광 계수 [M-1 c m-1] Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) 40 mg mL-1 50mm 두번째-트리 스, pH 6.5 1.1 M 나트륨 주석산, 50 mM Tris, pH 6.8 I4222, 1LR2 29420 포도 당 isomerase (Streptomyces rubiginosus) 25 mg mL-1 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.0 100 m 두번째-트리 스, 2.7 M 황산 암모늄, pH 5.7 m I222, 4ZB2 46410 Thioredoxin (사 상충) 34 mg mL-1 20 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0 27.5 %PEG1500, 100 밀리미터 SPG 버퍼, pH 6.3 P41212, 4FYU 24075 표 2: 결정 화 조건 및 단백질 결정 준비, 소멸 계수와 pdb 코드를 포함 하 여의 공간 그룹 단백질 노출된 결정의 수 크리스탈 당 회절 패턴의 수 노출 [°] 당 진동 범위 노출 시간 [ms] 씨에 대 한 PDB 항목 Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) 103 10 1 40 1LR2 포도 당 isomerase (Streptomyces rubiginosus) 69 100 0.1 80 4ZB2 Thioredoxin (사 상충) 68 10 1 40 4FYU 표 3: x 선 회절 데이터 컬렉션 매개 변수입니다. 데이터 컬렉션 통계는를 thaumatin(프레임 1-20) 포도 당 isomerase (프레임 1-100) thioredoxin(프레임 1-10) Beamline P14 파장 [Å] 0.96863 공간 그룹 P41212 I222 P42212 단위 셀 매개 변수: a = b의 c [Å] 58.62, 151.48 93.91 99.60, 103.04 58.45, 151.59 결정의 수 101 41 34 총 진동 [°] 10 10 10 해상도 [Å] 30.1.1989(1.95-1.89) 30.1.1975(1.80-1.75) 30.3.2000(3.20-3.00) 온도 [K] 296 296 296 R p.i.m.b 7.5 (25.5) 8.8 (28.0) 9.1 (33.2) 측정 된 반사 1553200 690000 1111196 고유한 반사 21850 48942 44449 평균 I/σ(I) 6.07 (1.78) 5.85 (1.66) 4.08 (1.47) Mn(I) 하프 세트 상관 관계 참조(1/2) 96.2 (72.2) 95.8 (68.2) 97.9 (75.3) 완성도 [%] 99.8 (100.0) 100.0 (99.9) 99.9 (100.0) 중복 71.1 14.1 25 상세 통계 해상도 범위 [Å] 1/30/1989 1/30/1975 2000 년 3 월 30 일 R / R무료 [%] 18.8/23.9 18.1/20.5 18.9/23.1 단백질 원자 1550 3045 1129 물 분자 51 111 164 Ligand 분자 20 0 0 Rms 편차 본드-길이 [Å] 0.02 0.026 0.01 채권 각도 [°] 2.04 2.22 1.43 B 요소 [Å2] 단백질 22.6 20 50 물 25.1 27.1 29.7 Ligand 20.4 야 Ramachandran 작 분석 가장 선호 지역 [%] 97.67 95.32 96.13 허용 된 지역 [%] 2.44 4.16 3.64 너 그 럽게 허용 지역 [%] 0.49 0.52 0.23 a: 괄호에서 값은 높은 해상도 쉘. b: (), 어디 내가 (hkl) 반사 hkl의 평균 강도, Σhkl 합계 모든 반사 이상 이며 Σi 합계 이상의 반사 hkl의 측정. 표 4: thaumatin, 포도 당 isomerase thioredoxin에서 데이터 집합의 데이터 수집 통계입니다. Supplementry-파일 1: chip_geometry.dwg. 사용 칩 형상의 CAD 파일입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. Supplementry 파일 2: goniometer_adapter.stl. STL 파일 x 선 칩 각도 어댑터를 지정 합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. Supplementry-파일 3: xds.sh. 웨지의 XDS 회절 데이터를 처리 하는 데 입력된 파일을 만들기 위한 스크립트를 강타. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. Supplementry 파일 4: xscale.sh. 회절 데이터 하위 집합을 병합 하 여 HKL 파일 만들 스크립트를 강타. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. Supplementry-파일 5: ISigma.sh. 모든 개별 하위 집합에서 ISigma 값을 추출 하는 스크립트를 강타. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. Supplementry-파일 6: Rmeas.sh. 모든 개별 하위 집합에서 Rmeas 값을 추출 하는 스크립트를 강타. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. Supplementry 파일 7: rotation_matrix.sh. 회전 매트릭스에서 오일러 각도를 계산 Matlab에 대 한 입력된 파일을 준비 하는 스크립트를 강타. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
우리는 창 소재로 소재와 폴 박 작성으로 에폭시 수 지를 패턴화 하 여 제자리에 x 선 회절에 대 한 미세 장치를 조작. 우리의 절차 이전 x 선 칩 디자인16,21을 통해 제조 프로세스의 여러 단계를 최적화. 우리 창 두께 감소 하 고 그로 인하여 또한 제조를 완화 하는 동안 비 산 배경으로 적은 프로세스 단계는 필요. 제자리에서 결정 화 기술된 프로토콜을 사용 하 여 상당한 장점이 있습니다. 그것은 실내 온도에 회절 데이터 수집을 허용 하 고 그로 인하여 어떤 경우에 인공 단백질 구조에 소개의 위험을 포함 하는 곳을 알아내는 보호의 필요성을 제외. 또한, 크리스탈 적용 되지 않습니다 물리적 스트레스 때문에 그들의 네이티브 환경에서 결정의 양도 피할 수 있다. 이 절차를 통해 결정 그들의 고품질을 유지 하 고 어떤 치료에서 고통을 하지 않습니다.
우리의 경험에는 프로토콜 내에서 가장 중요 한 단계를 결정 화 과정을 통제 돌고 있다. X 선 적절 한 크기와 적당 한 결정을 얻기 위해 매개 변수 경험적으로 확인 될 필요가 있고 증기 확산 실험에서 직접 촬영 하실 수 없습니다. 항상 다른 칩, 또는 때때로 다른 우물 같은 칩 내에 결정에서 단백질 및 비례적 동일 농도 사용 하 여 발생 하지 않았다. 이 크리스탈 nucleation 및 성장에 영향을 미치는 모든 요인 고려 되어야 신중 하 게, 어머니 주류 구성 또는 결정 화 속도 론 (통해 증발 궤적) 등을 나타냅니다. 더 큰 결정은 더 높은 해상도를 diffract로 적당 하 게 큰 결정 이상적으로 성장 된다. 크리스탈 nucleation 및 성장 과정은 DL 측정 뒤 수 있습니다. ~ 50 µ m 내부 레이저 초점 조정 칩의 얇은 결정 화 구획 도전적 일 수 있다 고 주의 수동 정렬 해야 할 수도 있습니다. 100 µ m 보다 깊은 우물을 사용 하 여 레이저 자동 정렬 가능 하 고 신뢰할 수 있는, 같은 했다 여러 우물 자동된 취득 제도 통해 모니터링할 수 있습니다.
구체의 기반 x 선 칩 생산만 낮은 배경 하 고 루틴 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 이러한 장치의 적합성 3 모델 단백질에 대 한 구조를 해결 하 여 보여 줍니다. 훨씬 더 큰 단백질 결정 및 기존 선 데이터 수집에서 이전 달성된 해상도 비해 칩에서 얻은 최고의 해상도가 달랐다. 이 여러 요인으로 인해 될 수 있고 더 결정 화 조건 최적화는 회절 개선할 수 있습니다. 회절 데이터와 적용 크리스탈 30 µ m 보다 작은 크기 1.8 Å 해상도 제자리에 수집 가능 했다. 방사선 손상에 대 한 통찰력을 제공 하는 thaumatin 회절 데이터의 상세한 분석. 하 고 인접 결정에 래 디 칼의 확산을 발생할 수 있습니다 방사선 손상의 확장을 제한 하려면 하나의 단 결정 미세 장치에서 구획 당 노출 합니다. 데이터 수집의 속도 개선 하기 위해,이 한다 자동화 미래에.
크리스탈 형태학, 때문에 어떤 경우에 기본 방향을 발생할 수 있습니다. 이것은 예 thioredoxin 데이터 집합의 경우 크리스탈 칩 윈도우 기준으로 강력 하 게 원하는 방향을 했다. 여기에 완전 한 회절 데이터 집합을 수집 수 합니다. 결정 전시 칩에 기본 방향 및 특히 해당 공간 그룹은 또한 낮은 대칭, 경우 다음 데이터 집합의 완전성 모니터링 해야 컬렉션 동안 충분 한 회절 패턴 지팡이 하도록 하는 경우 수집.
이러한 칩을 사용 하 여 시간 해결 연구는 빛을 사용 하 여 펌프-프로브 방식으로 반응을 유발 하는 경우 직접 가능 합니다. COC를 사용할 수 또는 폴 호 일 광선 전송 펌프 레이저에 대 한 해명 되 고 또는 광학 투명 폴 필요 합니다. 현재 미세 형상 결정 성장 후 실험을 혼합 하는 기판에 대 한 허용 하지 않습니다. 그러나, 우리는 또한 같은 혼합 두 시간 해결 x 선 회절에 대 한 디자인으로 접근19뿌리에 적합 하도록 설명된 x 선 칩 제조 프로토콜을 기대 합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부두 씨앗 기금 PIF-2015-46에 의해 지원 되었다, 05K16GUA 및 05K12GU3, 그리고는 독일의 ‘ 초고속 영상-구조, 역학 및 원자 규모에서 물질 제어를 위한 함부르크 센터 ‘ 우수 클러스터는 BMBF 부여 가운데 (DFG)입니다. 자유 전자 레이저 과학을 위한 센터와 제휴 하는 작가의 작업 지향 프로그램 기금을 통해 헬름홀츠 협회에 의해 투자 되었다. 싱크 로트 론 MX 데이터 페트라 III 저장 링 (DESY, 함부르크, 독일)에 의해 EMBL 함부르크 beamline P14 운영에 모아 졌다.
Materials
| SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
| PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
| Isopropyl alcohol | Solvent | ||
| Ethanol | Solvent | ||
| Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
| Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
| APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
| GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
| Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
| CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
| HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
| AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
| Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
| Photo mask | JD Photo Data | ||
| 3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
| Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
| PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
| Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
| Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
| Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
| Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
| Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
| HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
| Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
| PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
| SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
| SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
| Form2 | Formlabs | 3D printer | |
| Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
| Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
| Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
| Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |
References
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Cite This Article
Gicquel, Y., Schubert, R., Kapis, S., Bourenkov, G., Schneider, T., Perbandt, M., Betzel, C., Chapman, H. N., Heymann, M. Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography. J. Vis. Exp. (134), e57133, doi:10.3791/57133 (2018).