Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Comme les macrophages du parenchyme CNS, microglie interagir avec une vaste gamme de circuit neuronal et gliales réseaux de signalisation. Ils jouent un rôle vital dans le développement et l’homéostasie du cerveau par élagage synaptique, dégagement de cellules apoptotiques et transitoires interactions avec les processus neuronaux^1,2. Les microglies sont premiers intervenants de lésions neurologiques, étendre leurs processus longs et minces aux sites de la lésion pour coordonner les réactions inflammatoires et de limiter les saignements^3,4. Changements dans la morphologie des microglies et la fonction sont omniprésents dans les blessures de CNS aiguës et chroniques et la microglie pièce modifiée morphologie, localisation et l’expression de médiateurs inflammatoires dans un large éventail d’États de maladie¹. Des études génétiques humains indiquent que les mutations qui modifient le risque de maladies neurodégénératives sont souvent principalement ou exclusivement exprimées par la microglie dans le SNC intact, pointant vers un rôle critique pour la microglie dans la pathogenèse de la maladie ou la progression⁵ . Compte tenu de leur importance dans les blessures et les maladies, favoriser la compréhension de la biologie de la microglie est hautement prioritaire pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Nombreuses avancées essentielles à la compréhension de la biologie des microglies ont surgi en extrapolant des techniques et mécanismes découverts dans les études d’autres populations de macrophage, y compris les méthodes de culture, profils d’expression génique et définitions de fonctionnelle / morphologiques États. Bien que généralisée macrophage fonctions souvent se dérouler de façon surprenante dans le paysage de la CNS, les microglies sont elles-mêmes hautement spécialisé, présentant une morphologie ramifiée et une signature d’expression de gène unique qui les distingue des autres tissus macrophages⁶. La microglie ont une lignée qui se distingue de la plupart des autres macrophages tissulaires ; ils colonisent le système nerveux central au cours d’une vague embryonnaire précoce de l’hématopoïèse primitif et se renouvellement tout au long de la vie, indépendamment des contributions de l’hématopoïèse définitive⁷. La signature d’expression de gène de pleine maturité des microglies adulte n’est pas atteint jusqu’à la deuxième semaine après la naissance⁸. Les signaux environnementaux des tissus environnants jouent un rôle majeur en dictant des macrophages de tissu-spécifiques caractéristiques⁶, qui dans le système nerveux central comprend une exposition limitée à facteurs hématogène accordée par la barrière hémato – encéphalique⁹.

Un obstacle pour comprendre pleinement microgliales contributions à l’homéostasie du CNS et de la maladie est la difficulté de récapitulant les propriétés spécialisées des microglies mature vu en vivo avec cellules purifiées in vitro. Plusieurs méthodes ont été développées pour isoler et culture microglie intacte, mais la plupart des approches dépendent de sérum à l’appui de la survie des cellules. Nous avons montré que l’addition de sérum, qui est un réactif par nature variable contenant une vaste gamme de molécules bioactives, est particulièrement problématique lorsque travailler avec les cellules microgliales parce qu’elle encourage une morphologie amiboïde, augmente la prolifération, et phagocytose accrue⁹ a souvent vu dans vivo quand microglie sont exposés à des facteurs de diffusion hématogène après la rupture de la barrière hémato – encéphalique. Par ces mesures, exposés au sérum de cellules ressemblent à des microglies de blessures ou de maladies, mais ces altérations sont réduites quand les microglies sont cultivées en milieu défini contenant du CSF-1 (ou IL-34), le TGF-β, cholestérol et sélénite.

Ce protocole fournit des détails pour la culture des microglies rat juvénile dans des conditions sans sérum, associés à des travaux récemment publiés⁹. Ce protocole a été simplifié pour les rats de jour après la naissance 21-30 (P21 – P30), mais peut être adapté pour isoler la microglie de rats et de souris de n’importe quel âge, bien que le rendement et la viabilité globale variera selon l’espèce et l’âge de l’animal. Rendement maximal et viabilité optimale est obtenue lors de l’utilisation des microglies légèrement immatures (~ P9), avec des rendements et de la viabilité s’amenuisant progressivement à un peu plus faibles chez les animaux adultes. Microglies peuvent aussi être isolé chez des souris, mais nous avons trouvé que des cellules de rat montrent des rendements significativement plus élevée, la viabilité et complexité des morphologies ramifiés, comparativement aux cellules de la souris dans les cultures sans sérum. Animaux âgés de plus de P50 n’ont pas été évalués avec ce protocole. Cette procédure d’isolement d’immunopanning a été optimisée afin de minimiser les variations des profils transcriptionnelle microgliales lors de l’isolation et de maximiser la viabilité des cellules en aval. En utilisant ces techniques et les formulations de médias, des cultures primaires de haute-viabilité peuvent être maintenues pendant des semaines. Cultivées dans ces conditions la microglie présentent une morphologie très ramifiée impliquant rapide et la rentrée des processus et relativement faible taux de prolifération. Nous mettre en évidence l’importance du sérum-exposition sur ces propriétés et discuter des points forts et les faiblesses de cette méthode par rapport à d’autres approches.