Enfoque de dos pasos para explorar y finales-inicios de la formación de órganos en el modelo aviar: el timo y glándulas paratiroides organogénesis paradigma
Summary
Este artículo proporciona un acercamiento actualizado al sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar la formación del órgano, mediante la combinación de nuevos procedimientos experimentales in vitro e in ovo .
Abstract
El embrión aviar, como un modelo experimental, ha sido de suma importancia para descubrimientos seminales en Biología del desarrollo. Entre varios enfoques, la formación de quimeras de pollo de codorniz y el uso de las membranas corioalantoideas (CAM) para sostener el desarrollo de tejidos ectópicos remontan al siglo pasado. Hoy en día, la combinación de estas técnicas clásicas con las últimas metodologías en vitro ofrece nuevas perspectivas para profundizar en la formación de órganos.
Aquí se describe un enfoque de dos pasos para estudiar y finales-inicios de la organogénesis. Brevemente, la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo del órgano es aislada de embriones de codorniz y crecido en vitro en un sistema organotypic (hasta 48 h). Los tejidos cultivados son posteriormente injertados en la leva de un embrión de pollo. Después de 10 días de desarrollo en ovo , órganos completamente formados se obtienen de los tejidos injertados. Este método también permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos y la manipulación genética del tejido a lo largo de los pasos del desarrollo in vitro e in ovo . Además, el desarrollo de los tejidos puede recogerse en cualquier ventana de tiempo para analizar su perfil de expresión génica (mediante PCR cuantitativa (qPCR), microarrays, etc.) y morfología (evaluado con biopsia e histología convencional).
El procedimiento experimental descrito puede utilizarse como una herramienta para seguir la formación del órgano fuera el embrión aviar, de las primeras fases de la organogénesis completamente formado y órganos funcionales.
Introduction
Embriones aves han sido ampliamente utilizados en estudios de Biología del desarrollo seminal. Las principales ventajas del modelo aviar incluyen la posibilidad de abrir el huevo, el relativamente fácil acceso al embrión y la capacidad para realizar la micromanipulación. Algunos ejemplos incluyen el sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar células destino1, aplicación de factores de crecimiento específicos al embrión2y el crecimiento de las estructuras celulares ectópicos en el CAM1,3, 4.
Para obtener nuevos conocimientos en distintas etapas de la formación de órganos, recientemente hemos desarrollado un método que combina técnicas de injertos en vitro la manipulación de los tejidos embrionarios5. El enfoque de dos etapas permite la discriminación y la exploración de ambos – y finales-inicios de la organogénesis, que a menudo se limitan debido a interacciones de tejido altamente dinámicos y complejos2. Por otra parte, la falta de marcadores específicos de tejido adecuados con frecuencia limita el uso de transgénicos modelos animales6. Este novedoso método del enfoque de dos pasos en gran medida supera tales limitaciones.
Para estudiar las primeras etapas de formación del órgano, en el primer paso, el territorio embrionario codorniz que comprende el rudimento de órgano prospectivo es aislado y crecido en un sistema de organotypic in vitro durante 48 h. Durante este período, modulación farmacológica de vías de señalización específicas puede realizarse mediante la adición de drogas en el medio de cultivo5,7. Además, los tejidos cultivados pueden ser recogidos en cualquier etapa de crecimiento en vitro y sondeados para expresión génica (usando métodos tales como qPCR, microarrays, etc.).
En el segundo paso, 48 tejidos h cultivadas son entonces injertados en la leva de un embrión de pollo (c) en el día embrionario (E) 8 (cE8) (Hamburger y Hamilton (HH)-etapas de 33-35)8. La cámara se comporta como un surtidor vascular de nutrientes y permite gas intercambios1,3,4 a los tejidos injertados que permite su desarrollo en ovo por períodos más largos de tiempo. Este paso experimental es especialmente idóneo para estudiar las últimas etapas de la organogénesis, como órganos completamente formados pueden obtenerse después de 10 días en ovo desarrollo5,9,10,11 . Análisis morfológico se realizan fácilmente por la histología convencional para confirmar la formación adecuada del órgano y origen del donante de las células puede ser identificado por immunohistochemistry usando los anticuerpos específicos para cada especie (es decir, MAb codorniz PeriNuclear (QCPN)). Durante el período de incubación de la CAM, injertos también ser crecidos en presencia de agentes farmacológicos y recogidos en cualquier etapa de desarrollo para evaluar la progresión de la organogénesis.
El enfoque de dos pasos, descrito aquí en profundidad, ya se ha empleado en Figueiredo et al. 5 para explorar el desarrollo de primordio común aviar paratiroides/timo. En consecuencia, las particularidades inherentes de los territorios embrionarios y etapas de desarrollo en la organogénesis de la timo y las glándulas paratiroides se presentará a continuación.
El timo y el epitelio de las glándulas paratiroides, aunque funcionalmente distintas, deriva del endodermo de las bolsas faríngeas (PP)12. En aves, los epitelios de estos órganos proceden de la tercera y cuarta PP endodermo (3/4PP)12, mientras que en los mamíferos el epitelio tímico deriva la 3PP y el epitelio de las glándulas paratiroides deriva del 3PP y 3/4PP en ratón y humano, respectivamente de13,14.
Una de las etapas más tempranas en la formación de estos órganos es la aparición de discreta timo y paratiroides dominios en el primordio común. En los pollos, estos dominios pueden identificarse por hibridación en situ , con marcadores moleculares específicos, E4.515. Medida que avanza el desarrollo, estos rudimentos de órganos individualizan y separan de la faringe, mientras que rodea una cápsula mesenquimal fina, formada por las células derivadas de la cresta neural, (en E5; HH-stage 27). Más tarde el epitelio tímico es colonizado por células progenitoras hematopoyéticas (en E6.5; HH-stage 30)12.
Como en estudios clásicos de codorniz-gallina de1,12, el enfoque de dos pasos es particularmente útil para estudiar la formación de los órganos hematopoyéticos/linfoide, es decir el timo5. Como explante de la codorniz, con el rudimento del órgano, se injerta en el embrión de pollo antes de la colonización de células progenitoras hematopoyéticas, un timo quimérico se forma con las células del progenitor transmitidas por la sangre del pollo infiltrando una contraparte epitelial tímica de codorniz. Por lo tanto, este método es una herramienta útil para explorar la contribución de las células hematopoyéticas en el desarrollo del sistema hemato/linfoide aviar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un aspecto crucial para el éxito de este método es la calidad del pollo y codornices huevos. Teniendo en cuenta los períodos de incubación, especialmente durante el ensayo en ovo , una buena calidad de huevos de gallina mejora viabilidad precios (hasta un 90%) al final del procedimiento. Para lograr esto, prueba de huevos de diferentes proveedores. Incubar los huevos unmanipulated durante largos períodos (hasta 16-17 días) y comprobar su desarrollo. Para ser considerado un lote de buena calidad, más del 8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están agradecidos con António Cidadão, Isabel Alcobia y Leonor Parreira para la lectura crítica del manuscrito, a Padma Akkapeddi para la narración del video, y a Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desarrollo, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con sistema de video y Interaves – Sociedade Agro-pecuaria, S.A. para contribuir con codorniz huevos fertilizados. Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
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