De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma
Summary
Dit artikel bevat een bijgewerkte aanpak van de klassieke kwartel-kip chimera systeem te bestuderen van de vorming van het orgel, door het combineren van nieuwe in vitro en in ovo experimentele procedures.
Abstract
De aviaire embryo, is als een experimenteel model, van het grootste belang voor baanbrekende ontdekkingen in Ontwikkelingsbiologie. Onder de verschillende benaderingen, de vorming van kwartel-kip Chimaera en het gebruik van het chorion membraan (CAM) te ondersteunen van de ontwikkeling van ectopische weefsels dateren uit de vorige eeuw. Tegenwoordig, biedt de combinatie van deze klassieke technieken met recente in vitro methoden nieuwe perspectieven om orgel vorming verder te verkennen.
Hier beschrijven we een aanpak in twee stappen om te bestuderen van de vroege – en late-stadia van organogenese. Kortom, de embryonale regio met het vermoedelijke grondgebied van het orgel is geïsoleerd van kwartel embryo’s en gekweekt in vitro in een organotypic systeem (max. 48 uur). Gekweekte weefsels zijn vervolgens geënt op de nok van een embryo van de kip. Na 10 dagen in ovo ontwikkeling, worden volledig gevormde organen geënte weefsels verkregen. Deze methode maakt het ook mogelijk de modulering van de trajecten door de regelmatige toediening van farmacologische agenten en de genetische manipulatie weefsel in in vitro en in ovo ontwikkelingsstadia signalering. Bovendien kan ontwikkelen weefsels worden verzameld op een tijd-venster om hun-genexpressie profiel (met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR), microarrays, etc.) en morfologie (beoordeeld met conventionele histologie en Immunochemie) te analyseren.
De beschreven experimentele procedure kan worden gebruikt als een instrument om te volgen orgel vorming buiten het aviaire embryo, van de vroege stadia van de organogenese volledig gevormd en functionele organen.
Introduction
Aviaire embryo’s hebben wijd gebruikt in rudimentaire ontwikkelingsbiologie studies. De belangrijkste voordelen van het aviaire model omvatten de mogelijkheid om te openen het ei, de relatief makkelijke toegang tot het embryo en de mogelijkheid voor het uitvoeren van micromanipulation. Voorbeelden omvatten de klassieke kwartel-kip chimera-systeem voor het bestuderen van de cel lot1, toepassing van de specifieke factoren die de groei naar de embryo2, en de groei van ectopische cellulaire structuren in de CAM1,3, 4.
Als u nieuwe inzichten in de verschillende fasen van de formatie van het orgel, hebben we onlangs een methode die praktijk technieken met in vitro manipulatie van embryonale weefsels5 combineertontwikkeld. De aanpak in twee stappen kan de discriminatie en de exploratie van beide vroege – en late-stadia van organogenese, die vaak beperkt als gevolg van de zeer dynamische en complexe weefsel interacties2. Bovendien, het gebrek aan geschikte weefsel-specifieke markeringen vaak beperkt het gebruik van genetisch gemodificeerde diermodellen6. Deze nieuwe methode van de aanpak in twee stappen overwint grotendeels dergelijke beperkingen.
Om te studeren beginstadia van orgel vorming, in de eerste stap is de kwartel embryonale grondgebied bestaande uit de grondbeginselen van de toekomstige orgel geïsoleerd en gekweekt in een in vitro organotypic systeem voor 48 uur. Tijdens deze periode kan de farmacologische modulatie van specifieke signaalroutes door toevoeging van drugs aan het kweekmedium5,7worden uitgevoerd. Bovendien, gekweekte weefsels kunnen worden verzameld in elk stadium van de groei in vitro en peilden voor gen-expressie (met behulp van methoden zoals microarrays, qPCR, enz.).
In de tweede stap, 48 h-gekweekte weefsels zijn dan geënt op de nok van een embryo van de kip (c) ten embryonale dage (E) 8 (cE8) (Hamburger en Hamilton (HH)-stadia van 33-35)8. De CAM gedraagt zich als een vasculaire leverancier van voedingsstoffen en laat gas uitwisseling1,3,4 te geënte weefsels zijn ontwikkeling in ovo inschakelen voor langere tijd. Deze experimentele stap is vooral geschikt om te studeren van late-stadia van organogenese, als volledig gevormde organen kunnen worden verkregen na 10 dagen ovo ontwikkeling5,9,10,11 . Morfologische analyse is gemakkelijk uitgevoerd door conventionele histologie te bevestigen goede orgel vorming en donor oorsprong van cellen kan worden geïdentificeerd door immunohistochemistry met soortspecifieke antilichamen (d.w.z., MAb kwartel PeriNuclear (QCPN)). Tijdens de incubatietijd van de CAM, kunnen transplantaties ook worden gekweekt in aanwezigheid van farmacologische agenten en verzameld in elk stadium van ontwikkeling te evalueren van de voortgang van de organogenese.
De aanpak in twee stappen, die hier worden beschreven in de diepte, is reeds werkzaam zijn in de Figueiredo et al. 5 om te verkennen de aviaire bijschildklier/zwezerik gemeenschappelijk primordium ontwikkeling. Dienovereenkomstig, zal de inherente bijzonderheden van de embryonale gebieden en stadia van ontwikkeling betrokken is in de organogenese van de thymus en bijschildklier klieren hieronder worden gepresenteerd.
De zwezerik en de bijschildklier klieren epitheel, ontlenen maar functioneel distinct, de endoderm van de faryngaal zakjes (PP)12. In vogels, het epitheel van deze organen zijn afkomstig uit de derde en vierde PP endoderm (3/4PP)12, terwijl bij zoogdieren de serie epitheel is afgeleid van de 3PP en het epitheel van de bijschildklier klieren is afgeleid van de 3PP en 3/4PP in de muis en de mens, respectievelijk13,14.
Een van de vroegste stadia in de vorming van deze organen is de opkomst van discrete zwezerik en parathyroid domeinen in de gemeenschappelijke primordium. In kip, kunnen deze domeinen worden geïdentificeerd door in situ hybridisatie, met specifieke moleculaire markers, op E4.515. Ontwikkeling opbrengst, deze orgel rudiments individualiseren en scheiden van de keelholte, terwijl een dunne mesenchymale capsule, gevormd door neurale crest-afgeleide cellen, hen (bij E5 omringt; HH-stage 27). Later is de serie epitheel gekoloniseerd door hematopoïetische voorlopercellen (op E6.5; HH-stage 30)12.
Zoals in de klassieke studies van kwartel-kip1,12is de aanpak in twee stappen met name nuttig zijn te onderzoeken van de vorming van hematopoietische/lymfoïde organen, namelijk de thymus5. Zoals de kwartel, met de grondbeginselen van het orgel explant, is geënt in het embryo van de kip voorafgaand aan de kolonisatie van hematopoïetische voorlopercellen cel, wordt een chimeer thymus gevormd met kip bloed overgedragen voorlopercellen infiltreren van een kwartel serie epitheliale tegenhanger. Deze methode is dus een nuttig instrument om te verkennen van de bijdrage van hematopoietische cellen in de ontwikkeling van de aviaire hemato/lymfoïde systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een cruciaal aspect voor het succes van deze methode is de kwaliteit van zowel de kip en kwartel eieren. Gezien de lange incubatietijd tussenliggende perioden, met name in de in ovo assay, een goede kwaliteit van kippeneieren verbetert tarieven levensvatbaarheid (tot 90%) aan het einde van de procedure. Om dit te bereiken, test u eieren van verschillende leveranciers. Unmanipulated eieren Incubeer gedurende lange perioden (maximaal 16-17 dagen) en controleren van hun ontwikkeling. Meer dan 80% van de embryo’s di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn António Cidadão, Isabel Alcobia en Leonor Parreira dankbaar voor de kritische lezing van het manuscript, om Padma Akkapeddi voor video commentaar, en Vitor Proa vanaf de betekening van de histologie van de Instituto de Histologia e Biologia wilt opgeven Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, voor technische ondersteuning. Wij zijn met name dank verschuldigd Paulo Caeiro en Hugo Silva uit de Unidade de audiovisuais (Unit audiovisuele media), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa voor hun uitstekende inzet voor de productie van deze video. Wij erkennen Leica Microsystems voor het vriendelijk het verstrekken van een stereoscoop uitgerust met videosysteem en Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A om bij te dragen met kwartel eieren bevrucht. Dit werk werd gesteund door Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
