نهج خطوتين لاستكشاف ومتأخرة-المراحل الأولى من تشكيل الهيئة في نموذج إنفلونزا الطيور: الغدة الصعترية ونموذج Organogenesis الغدد الجار درقية
Summary
توفر هذه المقالة نهج تحديث للنظام الكلاسيكي الدجاج السمان الوهم لدراسة تكوين الجهاز، ومن خلال الجمع بين رواية الإجراءات التجريبية في المختبر و في ovo .
Abstract
كان الجنين إنفلونزا الطيور، كنموذج تجريبي، أهمية قصوى للاكتشافات الأصيلة في علم الأحياء التنموي. من بين العديد من الطرق وتشكيل التركيبات السمان-الدجاج واستخدام الغشاء تشوريوالانتويك (كام) لمواصلة تطوير أنسجة خارج الرحم تاريخ يعود إلى القرن الماضي. في الوقت الحاضر، يقدم المزيج من هذه الأساليب الكلاسيكية مع المنهجيات الحديثة في المختبر آفاق الرواية مواصلة استكشاف تشكيل الجهاز.
هنا يصف لنا نهجاً خطوتين للدراسة ومتأخرة-المراحل الأولى من أورجانوجينيسيس. بإيجاز، منطقة الجنينية التي تحتوي على الإقليم المفترض للجهاز يتم عزل من الأجنة السمان، ونمت في المختبر في نظام أورجانوتيبيك (ما يصل إلى 48 ساعة). وفي وقت لاحق يتم المطعمة الأنسجة المستزرعة على كام جنين الدجاج. بعد 10 أيام تنمية في ovo ، يتم الحصول على أجهزة شكلت بالكامل من الأنسجة المطعمة. يسمح هذا الأسلوب أيضا تحوير مما يشير إلى مسارات الإدارة العادية لوكلاء الدوائية والتلاعب بالجينات الأنسجة في جميع أنحاء الخطوات الإنمائية في المختبر و في ovo . بالإضافة إلى ذلك، وضع الأنسجة يمكن جمعها في أي إطار زمني تحليل التعبير الجيني الشخصية (باستخدام PCR الكمي (قبكر), [ميكروارس], إلخ) ومورفولوجيا (تقييم مع الأنسجة التقليدية وإيمونوتشيميستري).
يمكن استخدام الإجراء التجريبي المبين كأداة لمتابعة تكوين الجهاز خارج الجنين إنفلونزا الطيور، من المراحل المبكرة من organogenesis تماما تشكيلها والأجهزة الفنية.
Introduction
أجنة الطيور قد استخدمت على نطاق واسع في دراسات علم الأحياء التنموي المنوي. وتشمل المزايا الرئيسية لنموذج إنفلونزا الطيور إمكانية فتح البيضة، ووصول سهلة نسبيا للجنين، والقدرة على أداء ميكرومانيبوليشن. بعض الأمثلة تشمل نظام كلاسيك الدجاج السمان الوهم لدراسة الخلية مصير1، وتطبيق عوامل نمو معينة ل الجنين2، ونمو الهياكل الخلوية حمل خارج الرحم في كام1،3، 4.
للحصول على أفكار جديدة إلى مراحل متميزة لتكوين الجهاز، وضعنا مؤخرا أسلوب الذي يجمع بين تقنيات التطعيم بالتلاعب في المختبر من الأنسجة الجنينية5. تمكين النهج خطوتين التمييز والاستكشاف لكلا-وأواخر-المراحل الأولى من أورجانوجينيسيس، التي غالباً ما تكون محدودة بسبب تفاعلات الأنسجة المعقدة وديناميكية عالية2. وعلاوة على ذلك، عدم وجود علامات خاصة بالانسجة مناسبة كثيرا ما يحد من الاستخدام الكائنات المعدلة وراثيا النماذج الحيوانية6. هذا الأسلوب رواية النهج خطوتين إلى حد كبير ويتغلب على هذه القيود.
دراسة المراحل الأولى لتكوين الجهاز، في خطوة أولى، معزولة الإقليم الجنينية السمان تتألف من بداية الجهاز المرتقب ونمت في نظام أورجانوتيبيك في المختبر ح 48. خلال هذه الفترة، يمكن أن يؤديها التشكيل الدوائية لمسارات إشارات محددة إلى إضافة الأدوية إلى5،المتوسطة الثقافة7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن جمعها في أي مرحلة من النمو في المختبر الأنسجة المستزرعة وسبر للتعبير الجيني (باستخدام أساليب مثل قبكر، [ميكروارس]، إلخ).
في الخطوة الثانية، ثم يتم المطعمة الأنسجة المستزرعة ح 48 على كام جنين الدجاج (ج) في يوم الجنينية (ه) 8 (cE8) (همبرغر وهاملتون (ح ح)-مراحل 33-35)8. كام يتصرف كمورد الأوعية الدموية من المواد الغذائية، ويسمح للغاز التبادلات1،3،4 للأنسجة المطعمة التمكين على التنمية في ovo لفترات أطول من الوقت. هذه خطوة تجريبية خاصة أيضا مناسبة لدراسة المراحل المتأخرة من أورجانوجينيسيس، كما يمكن الحصول على أجهزة شكلت بالكامل بعد 10 أيام في ovo التنمية5،،من910،11 . بسهولة إجراء التحليل المورفولوجي بالانسجة التقليدية لتأكيد تشكيل الجهاز السليم، ويمكن تحديد الجهات المانحة المنشأ من الخلايا إيمونوهيستوتشيميستري باستخدام الأجسام المضادة إبلاغها (أيماب السمان بيرينوكلير (قكبن)). خلال فترة الحضانة كام، يمكن أيضا تزايد حضور وكلاء الدوائية الطعوم وجمعها في أي مرحلة من التنمية لتقييم تطور organogenesis.
النهج خطوتين، الموصوفة هنا في العمق، واستخدمت فعلا في فيغيريدو et al. 5 لاستكشاف وضع الغدة الدرقية إنفلونزا الطيور/الغدة الصعترية primordium المشتركة. وبناء على ذلك، ستعرض الملازمة لخصوصيات الأقاليم الجنينية ومراحل التنمية المشتركة في أورجانوجينيسيس الغدة الصعترية والغدد الدرقية أدناه.
الغدة الصعترية والغدد الدرقية ابيثيليا، على الرغم من الناحية الوظيفية المتميزة، تستمد من الأنسجة الحقائب البلعوم (PP)12. في إنفلونزا الطيور، ابيثيليا هذه الأجهزة تنبع من الثالثة والرابعة PP الأنسجة (3/4PP)12، بينما في الثدييات ظهارة الغدة الصعترية مستمد من 3PP وظهاره الغدة الدرقية الغدد مستمد من 3PP و 3/4PP في الماوس والبشرية، على التوالي من13،،14.
واحدة من المراحل الأولى في تشكيل هذه الأجهزة هو ظهور الغدة الصعترية المنفصلة والمجالات جارات الدرق في بريمورديوم المشتركة. الدجاج، ويمكن تحديد هذه المجالات بالتهجين في الموقع ، مع علامات جزيئية محددة، في E4.515. كما عائدات التنمية، هذه الهيئة ترافع تفريد وفصل من البلعوم، بينما كبسولة الوسيطة رقيقة، شكلتها الخلايا المستمدة من قمة العصبية، يحيط بهم (في E5؛ 27 هستاجي). وفي وقت لاحق من استعمر ظهارة الغدة الصعترية الخلايا المكونة للدم السلف (في E6.5؛ هستاجي 30)12.
كما هو الحال في الدراسات الكلاسيكية الدجاج السمان1،12، نهج خطوتين مفيد بشكل خاص لدراسة تشكيل الهيئات المكونة للدم/اللمفاوية، الغدة الصعترية هي5. كما explant السمان، مع بداية الجهاز، هو المطعمة في جنين الدجاج قبل استعمار الخلايا المكونة للدم السلف، تتشكل الغدة الصعترية تشيميريك مع الدجاج السلف التي يحملها الدم الخلايا التسلل إلى نظير الظهارية الغدة الصعترية السمان. هذا الأسلوب، لذلك، أداة مفيدة لاستكشاف المساهمة الخلايا المكونة للدم في تطوير نظام حمتو/اللمفاوية إنفلونزا الطيور.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحد جوانب حاسمة لنجاح هذا الأسلوب هو نوعية كل من الدجاج والسمان البيض. النظر في فترات حضانة طويلة، لا سيما أثناء الفحص في ovo ، ذات نوعية جيدة من بيض الدجاج يحسن معدلات البقاء (تصل إلى 90 في المائة) في نهاية الإجراء. ولتحقيق ذلك، اختبار البيض من مختلف الموردين. احتضان البيض unmanipulated لفترات ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ممتنون لانطونيو نظراً وايزابيل الكوبايا باريرا ليونور لقراءة نقدية من المخطوطة، أن بادما أكابيدي للفيديو والسرد، والقيام Proa فيتور من “دائرة علم الأنسجة” ه هيستولوجيا دي معهد بيولوجيا التنمية، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة، لتقديم الدعم التقني. ونحن مدينون لا سيما كايرو باولو و “هوجو سيلفا” من مقاتلي دي أوديوفيسوايس (الوحدة السمعية البصرية)، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي يسبوا على التزامهم المعلقة بإنتاج هذا الفيديو. ونعترف Microsystems إيكا يرجى توفير ستيريوسكوبي مزودة بنظام الفيديو وإلى إينتيرافيس–شركة زراعية-سنة, S.A للمساهمة مع السمان يخصب البيض. هذا العمل كان يدعمه دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة (فمول).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
