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Developmental Biology

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Published: April 12, 2018
doi:
10.3791/57084
, , , ,
1Department of Ophthalmology and Visual Science,Yale School of Medicine, 2Edward S. Harkness Eye Institute,Columbia University School of Medicine

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Abstract

Abgesehen von Vitaminen und Antioxidantien empfohlen von der Age-Related Eye Krankheit-Studie gibt es keine wirksame Therapie für “trocken” oder atrophischen Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD) entspricht 90 % der Fälle. Therapien sind nötig, um zu verlangsamen oder die Entwicklung der geografischen Atrophie (GA) zu verzögern, und Verständnis Bruchs-Membran-Pathologie ist Teil dieses Prozesses. Veränderungen im menschlichen Bruch-Membran vorausgehen das Fortschreiten der AMD durch einen Beitrag zur Beschädigung der retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zellen. Angesichts des Mangels an ausreichenden Tiermodellen, AMD zu studieren, dienen Ex Vivo Modelle im Alter von menschlichen Bruch-Membran, als ein nützliches Instrument zur Untersuchung des Verhaltens von RPE-Zellen von verewigt und Primärzelle Linien sowie RPE Linien von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Zellen (iPSCs). Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Methode, die es erlaubt, die Auswirkungen des RPE Zellen Verhalten ausgesät auf geernteten menschlichen Bruch Membran Explantaten von menschlichen Spendern, einschließlich Anhang, Apoptose und Proliferation, Fähigkeit, Photorezeptor äußeren phagocytize bestimmen Segmente, Einrichtung der Polarität und Genexpression. Dieser Test bietet ein ex-Vivo -Modell Alter Bruch-Membran zur Beurteilung der funktionellen Eigenschaften der RPE-Zellen bei der extrazellulären Matrix im Alter/gefährdet ausgesät.

Introduction

Altersbedingte Strukturveränderungen zu menschlichen Bruch-Membran, die von vielen Faktoren ab, einschließlich Nitrosative und oxidativen Stress verursacht wird übt mehrere nachteilige Auswirkungen auf die Funktion der retinalen Pigment (RPE) epithelialen Zellen und trägt zu den Pathologie der altersbedingten Makula-Degeneration (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Wenn man zellersatztherapie für fortgeschrittenen atrophischen AMD oder geographische Atrophie, benötigen Behandlung wahrscheinlich die Transplantation von Zellen auf einem Bett von RPE Zelle Atrophie. Altersbedingte Veränderungen im menschlichen Bruch-Membran können beeinträchtigen den Erfolg der transplantierten RPE Zelltransplantation, angesichts des Schadens an die extrazelluläre Matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Investigating Mensch Bruchs Membran Biologie und wie strukturellen Veränderungen innerhalb der Matrix dazu, das Fortschreiten zu AMD beitragen ist entscheidend für das Verständnis der Krankheit-Pathologie. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für die Ermittler im Feld altersbedingten Auge, Protokolle zu entwickeln, die beschreiben, die Ex Vivo Ernte von Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran.

Historisch gesehen wurde es schwierig, Modell altersbedingte Erkrankungen wie geographische Atrophie und ein Alter Mensch Bruch-Membran in Tiere23. Diese Schwierigkeit ergibt sich aus mehreren Faktoren, einschließlich die Langlebigkeit der Menschen im Vergleich zu Nagetiere und andere Arten, die häufig für Krankheit Modellierung sowie der Mangel an eine Makula in die meisten Wirbeltiere24verwendet. Der Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens ist, dass Zellen direkt auf Bruch Membran extrahiert aus Post Mortem Augen von Alter und/oder kranke Personen getestet werden können. Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Methode für eine Ex Vivo Modell der alten und/oder Kranken menschlichen Bruch-Membran bereitzustellen, einschließlich der Isolierung der menschlichen Bruch Membran explants von menschlichen Spendern und die Aussaat des RPE Zellen für nachgeschalteten Experimente. Dieses Modell dient als ein Modell zu untersuchen, den Beitrag der extrazellulären Matrix Schaden RPE Zelle Funktion und Pathologie20,25,26,27,28.

Protocol

Das folgende Protokoll erfolgt unter Beachtung der Grundsätze der Deklaration von Helsinki und der Yale University menschliche Forschung Ethik-Kommission Leitlinien. 1. Beschaffung menschlichen Spenders Augen Menschlichen Spenders Globen von der nationalen Krankheit Forschung Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) erhalten. Je nach Projekt bereiten Sie nicht weniger als drei Augenpaare Spender für jede experimentelle Gruppe. Enucleate Spender Augen innerhalb von 10 h und Schiff innerhalb von 48 Stunden post mortem. Dann transportieren Sie die Augen an das Labor in sterilen Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) Kulturmedium auf Eis. Zuvor haben die gemeldeten Studien gezeigt, dass Spender Augen geerntet und in dieser Mode-Reservat, die biologischen Funktionen und Aktivitäten des Bruchs Membran25,26,29 transportiert. 2. Gewinnung von menschlichen Bruch-Membran Explants Statt jedes Auge auf einem 1,5 x 1,5 Zoll Gaze mit Kohlendioxid-unabhängige DMEM Medien in einer Kulturschale 100 mm und Nutzung feine Klinge Schere getränkt, einen Schnitt durch die Lederhaut 3 mm nach dem Limbus zu machen und umlaufend in beide Richtungen erweitern. Machen einen voll-Dicke umlaufende Einschnitt (eindringen, Glaskörper) 1 mm Posterior, die Ora Serrata. Entfernen Sie und entsorgen Sie der vorderen augenabschnitt (Hornhaut, Linse und Iris) und der Netzhaut und Glaskörper. Verwenden Sie feine chirurgische Scheren, um vier radiale Einschnitte zwischen Sklera und Aderhaut machen, und dann schälen Sie der Sklera Weg von der Peripherie des Sehnervs und kümmert sich um zu vermeiden, reißen die Aderhaut/Bruch-Membran komplexe. Als nächstes machen Sie einen umlaufenden Schnitt durch den Suprachoroidal Raum entlang der Ora Serrata und schälen Sie die RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex nach hinten von der Sklera. Entfernen Sie native RPE-Zellen durch das Baden Explant mit 0,02 M Ammonium Hydroxid in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in 60 x 15 mm Polystyrol Petrischale für 20 min bei Raumtemperatur, gefolgt von bis zu dreimal in DPBS (Abbildung 1) waschen. Schweben Sie die Bruch-Membran komplexe Explant in Kohlendioxid-freie Medien über eine unveredelten, hydrophobe 65 µm dicken Polytetrafluorethylen Membran mit 0,2 µm-Poren mit der Basallamina Schicht aus jeder Explant mit Blick auf die Membran. Legen Sie eine Polytetrafluorethylen Membran mit Bruch Membran Explant auf einem fritted Glasträger in Vakuum Filterhalter Verglasungssystem Mikroanalyse. Glätten Sie die gewellten Kanten von der Aderhaut Seite mit feinen Pinzette beschichtet mit Teflon, kümmert sich nicht um die Bruch-Membran basale Laminin Seite berühren. 15 mL Agarose (4 % DPBS) Erhitzen und dann auf 37 ° c abkühlen lassen Gießen Sie dann 15 mL Sondennahrung Gel auf der Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex aus der Aderhaut-Seite während der Anwendung sanfte Saugwirkung um sicherzustellen, dass die modellabhängigen flach bleibt. Halten Sie das Gewebe bei 4 ° C für ca. 2-3 min., dann schälen Polytetrafluorethylen Membran entfernt und die Agarose zu festigen. Legen Sie den Bruch Membran Explant (1,5 Zoll im Durchmesser, in erstarrten Agarosegel) in ein 60 x 15 mm Polystyrol Zelle Kulturschale (mit Bruchs-Membran nach oben), die warme flüssige Agarose auf den Boden der Schale, die Bruch-Membran zu beheben gesäumt wurde Explant auf der Unterseite des Brunnens mit dem modellabhängigen basale Laminin-Layer nach oben. Die Agarose wird innerhalb von 2-3 min bei Raumtemperatur, die Bruch-Membran-Explantaten in der Kulturschale zu stabilisieren zu festigen. Abdeckung, die die Bruch-Membran in der Kultur explants Schüssel mit DPBS und das Gericht bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern. Abbildung 2A zeigt, dass die isolierten Bruch-Membran in der Kulturschale 60 x 15 mm explants. Wenn das gewünschte Kultur-System in eine 96-Well-Platte ist, legen Sie den Bruch Membran Explant (1,5 Zoll im Durchmesser, mit erstarrten Agarosegel) auf dem flachen Teflon Blatt mit Laminin-Seite oben. Mit einer Trephine, schneiden Sie fünf oder sechs, 6 mm-Rundschreiben-Schaltflächen aus der Bruch-Membran komplexe explant und jeweils auf 4 % Agarose bei 37 ° C in einem unbehandelten Polystyrol gut von einer 96-Well-Platte. Die Agarose wird innerhalb von 2-3 min bei Raumtemperatur, der Bruch Membran Explantate (Tasten) auf der Unterseite von jedem Bohrloch zu beheben zu festigen.Hinweis: Abbildung 2 b veranschaulicht trephined Bruch-Membran-Tasten in einer 96-Well-Platte. In der Regel können 9-11 Tasten oder Explantaten von jedem Auge geerntet werden. (3) Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zellen auf menschliche Bruch-Membran Explants Reinigen Sie nach Erhalt der Spender Augen die extraokulären Gewebe mit DPBS. Machen Sie einen umlaufenden Einschnitt 5 mm unterhalb der Iris-Sklera berühren Sie Punkt (Pars Plana) in den subretinalen Raum. Entsorgen Sie den vorderen augenabschnitt, Glaskörper und Netzhaut. Waschen Sie die Augenmuschel, enthält der Bruch Membran und RPE Blatt mit kalten DPBS. Die RPE-Zellen mit 5 mL Trypsin 0,25 % nicht länger als 10 Minuten pro Auge Probe zu distanzieren. Die Trypsin-Reaktion mit 25 mL DMEM komplette Medium mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C in einer 50 mL-Tube erwärmt zu stillen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für 10 min bei 24 ° C und das Pellet in 5 mL DMEM komplette Medium Aufschwemmen (mit 15 % FBS). Zählen der Zellen und Saatgut 15.000 tragfähige RPE-Zellen auf der Basallamina der jeweils verschiedenen Alter Bruch Membran Explantate (Tasten) in eine 96-Well-Platte in 200 µL serumfreien minimale wesentlichen Medien (MEM) mit Antibiotika (100 IE/mL Penicillin G, 100 mg / mL Streptomycin, 5 mg/mL Gentamicin und 2,5 mg/mL Amphotericin B). Unter der Annahme eines Zelle-Durchmesser von 20 µm, bei dieser Dichte Beschichtung ermöglicht RPE-Zellen um ca. 15 % des Gebiets Beschichtung zu decken. Platte die Zellen auf die Schaltfläche “, wobei die Zelldichte dann schrittweise bis zu 100 % Zusammenfluss je nach der Wirkung der einzelnen Parameter auf Zelle Verhalten erhöht werden kann. Ermöglichen Sie die Zellen Anfügen an den Explant für 24 h in eine feuchte Atmosphäre von 95 % air/5% CO2 bei 37 ° C. Verändern Sie Medium mit warmen komplette DMEM sanft.

Representative Results

Wenn Sie dieses Protokoll richtig durchgeführt ist, kann man die Auswirkungen von Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran auf Funktion der RPE-Zellen durch die Einrichtung der Polarität und der äußeren Blut-Retina-Schranke, polarisierte Sekretion von Wachstumsfaktoren und Zytokine bestimmen, und Phagozytose der Photorezeptor Stab außensegmenten. Wir haben Daten generiert, die einen Krankheit Phänotyp auf alten menschlichen Bruch-Membran zu demonstrieren. Zum Beispiel im Alter von Kultivierung RPE-Zellen auf menschliche Bruch Membran Explantaten sinkt RPE Zellen Wiederbefestigung (Abbildung 3). RPE-Zellen kultiviert auf alten menschlichen Bruch-Membran verringert sich die Kapazität dieser Zellen zu Stab außensegmenten (ROS), phagocytize eine kritische RPE-Funktion (Abbildung 4). Darüber hinaus können apoptotische Zellen identifiziert und auf diese Schaltfläche Explantaten mit einem terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick Ende-Beschriftung (TUNEL) Fleck wie beschrieben in früheren Arbeiten26verglichen werden. Die Auswirkungen der Membran, ein Alter und/oder kranken Menschen Bruchs auf RPE Zellen Genexpressionsprofil können mit Microarray-Technologie ermittelt werden. Wir haben gezeigt, dass die Genexpression RPE Zellen verändert wird, wenn auf menschliche Bruch-Membran von älteren Personen im Vergleich zu Explantaten von jüngeren Personen (Abbildung 5)27kultiviert. Zur statistischen Auswertung dienen Explantaten von menschlichen Spendern mindestens 3-5 pro Gruppe. Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolation des menschlichen Bruch-Membran aus Spender Augen. Menschlichen Bruch Membranen werden geerntet, indem entfernen, Sklera, vorderen augenabschnitt, Netzhaut, Glaskörper, und native Retinal pigment Epithelzellen (RPE). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Isolierte menschliche Bruch-Membran (BM) in der Kulturschale. (A) schematische Darstellung der menschlichen Bruch Membran Explantate (jeweils 1,5 Zoll im Durchmesser, mit erstarrten Agarosegel) platziert in einem 60 × 15 mm Polystyrol Zelle Kulturschale (BM bildoben) gefüllt mit warmen flüssigen Agarose auf der Unterseite der Schale. (B) eine menschliche Bruch Membran Explant, die in ein paar 6 mm Runde Knöpfe (Explantate), trephined wurde jeder IE wurde, dann auf 4 % Agarose bei 37 ° C in einem unbehandelten Polystyrol gut von einer 96-Well-Platte gelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3. Retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zell-Wiederbefestigung Rate auf junge und ältere Menschen Bruch-Membran (BM). Primäre RPE-Zellen wurden ausgesät auf Bruch Membran von jungen Explants Menschen ( 70 Jahre alten, n = 5) Spender Augen für drei Wochen. Zelle wurde Anlage durch MTT Zelle Lebensfähigkeit Assay gemessen. Ältere Menschen Bruch Membranen reduziert die RPE Zellen Anlage Rate von 24 % (junge BM 100 + / 8.54 S.E vs. ältere BM 76.65 + 1,44 / S.E). p < 0,05, S.E = Standardfehler. Abbildung 4. Retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zelle Phagozytose wird beeinflusst durch das Alter von der menschlichen Bruch-Membran (BM). Primäre RPE-Zellen kultiviert auf ältere Menschen, die Bruch Membran explants hatte eine reduzierte Fähigkeit, Stab außensegmenten (ROS) phagocytize (junge BM 873 + 9,3 / S.E., n = 5 vs. ältere BM 608 + 25,4 / S.E., n = 5). p < 0,01, S.E = Standardfehler. Abbildung 5. Anzahl der retinalen pigment epithelialen (RPE) Zelle Gene in jeder Probe kultiviert auf junge oder ältere Menschen Bruch-Membran explants. Es gab mehr Streuung in die Anzahl der Gene in primären RPE-Zellen ausgesät auf älteren im Vergleich zu jüngeren Menschen Bruch-Membran (6201 ± 388 vs. 6439 ± 80, beziehungsweise); für jede Altersgruppe wurden fünf Explantaten getestet. Präsentiert mit voller Zustimmung aller Autoren des Cai, H Et Al. 27. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Im Alter von menschlichen Bruch-Membran (extrazelluläre Matrix) trägt zum Fortschreiten Erkrankung von AMD und somit besteht die Notwendigkeit zu verstehen, wie diese veränderte Matrix zur RPE Zellen Dysfunktion beiträgt. Angesichts des Mangels an ausreichenden Tiermodellen, Altersbedingte Veränderungen bei AMD zu studieren, können ex Vivo Modellsysteme, die die Auswirkungen der Krankheit zu imitieren als ein wertvolles Instrument zur Pathophysiologie verstehen dienen. In diesem Manuskript beschriebene Methode kann verwendet werden, konsequent menschlichen explants Bruch Membran und Kultur RPE Zellen, einschließlich der primären, verewigt oder Stammzellen gewonnenen RPE-Zelllinien zu isolieren.

Wie bereits erwähnt, stammen aus der NDRI menschlichen Bruch-Membran-Explantaten. Ein Protokoll ist mit NDRI etabliert, die angibt, die Kriterien für Spender Augen akzeptabel zu sein. Z. B. Geber müssen keine bekannten Netzhaut Augenkrankheiten, Augen/Globen sind innerhalb von 10 Stunden nach dem Tod abgerufen und Globen im Labor innerhalb von 48 h nach dem Tod (durch Paket Nachtanlieferung auf Eis) ankommen. Geben Sie die entsprechende Altersgruppe und Anzahl der Augen benötigt für die statistische Analyse der Studie, zB., fünf Paare von Globen von Spendern im Alter zwischen 20-49 Jahre und fünf Globus Paare von Spendern im Alter von 50-89 Jahre.

Die Verfügbarkeit von Auge Globen variiert in der Regel durchschnittlich zehn Paar Kugeln zur Verfügung jeden Monat. Das Auge-Paket kommt mit grundlegenden, anonymisierte Spenderinformationen: Alter, ethnische Herkunft, Tod, Todesursache, sowie kurze medizinische Vorgeschichte (Krankheit Inserat oder Begleiterkrankungen).

Am wichtigsten ist, erfordert menschliche Bruch-Membran-Explantaten Ernte die Entfernung des vorderen Segments des Auges und Glaskörper, so dass für die Isolierung von der RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex. Sobald der Bruch-Membran isoliert ist, werden RPE-Zellen ausgesät auf die azellulären Explantaten in unterschiedlichen Konzentrationen und für nachgeschaltete Experimente kultiviert. Die Vorbereitung und verfahrensrechtliche Abwicklung wie hierin beschrieben ist von entscheidender Bedeutung, Aufmerksamkeit auf die Ausrichtung der isolierten Bruch-Membran, um sicherzustellen die laminal Oberfläche ist Verkleidung-Up während Sie berühren nicht die Oberfläche mechanisch zur Vermeidung von Schäden der extrazelluläre Matrix Oberflächenstruktur.

Anzumerken ist auch, dass wenn der Bruch-Membran-Explant-Systeme verwenden, gibt es einige Variablen, die beeinflussen könnten, nachgeschaltete Versuchsergebnisse wie einzelne Geber genomische Hintergrund, Alter der Bruch-Membran oder Post-mortem Tageszeit der Bruch Membran und den Speicherort der die Bruch-Membran, dh., zentralen oder peripheren Teil des Bruchs Membran Explantaten. Wie bei jeder anderen menschlichen Gewebes Studie, muss man die geeigneten Spender Auge Probennummer um die notwendige statistische Aussagekraft haben und passen Spender Auge Alter gegebenenfalls rekrutieren. Strenge Kriterien für die Annahme von Augen vom Auge Banken ist ein kritischer Parameter. Akzeptieren Sie nur Augen, das sind weniger als 10 h Post-mortem enukleiert und denen der Bruch-Membran-Vorbereitung innerhalb von 24-48 h nach Tod geerntet werden kann. Die Sehnerv-Website als ein Marker für die Ausrichtung verwendet werden, und verwenden die gleichen Standorte für experimentelle und Studiengruppen zu kontrollieren. Durch diese Maßnahmen kann man experimentelle Variabilität minimieren.

Zusammenfassend die RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex zu verstehen und wie es wird beeinflußt durch Alter und Krankheit ist entscheidend für ihren Beitrag zur Pathophysiologie von AMD zu verstehen. Modellsysteme, die ex Vivo Techniken beschäftigen sind ein wertvolles Instrument, um diese Effekte, die mit menschlichem Gewebe zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methodik, die menschlichen Spenders Explantaten als relevante Ex Vivo Modell Alter Bruch-Membran beschäftigt. Diese Technik erlaubt es, Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran zu verwenden, da ein Recherche-Tool zu untersuchen, wie strukturellen Veränderungen innerhalb der Matrix beeinflussen kann überlagern RPE Zellen Verhalten einschließlich der Anlage sowie Verbreitung und Gen Ausdruck25 , 27. erfolgreiche Entwicklung von ähnlichen ex Vivo Modellsystemen wird unser Verständnis der AMD und erleichtern die Entwicklung von neuartigen therapeutischen Optionen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung stützt sich auf Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit, New York, www.rpbusa.org und die Greater New York Center für Retinal Degenerative Krankheit Stiftung Fighting Blindness, www.blindness.org. Die Autoren möchten Luanna Bartholomew, Ph.d., danke für ihre kritische Überprüfung dieses Manuskriptes.

Materials

Human donor globes National Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995-065
Carbon-dioxide independent media Thermo Fisher Scientific 18045-088
60-mm polystyrene petri dish Corning Inc. 351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS Thermo Fisher Scientific 14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores Merck Millipore JGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system  Thermo Fisher Scientific 09-753-102
Agarose Sigma-Aldrich A2576-5G
35 × 10mm culture dish VWR International 25373-041
Trephine Accutome AM0570 60
96 well plate Corning Inc. 3595
Minimum essential media (MEM)  Thermo Fisher Scientific 11095-080 
Penicillin G Sigma-Aldrich P3032-1MU
Streptomycin Sigma-Aldrich S6501
Gentamicin Sigma-Aldrich G1914
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 1336-21-6
 
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References

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Cai, H., Gong, J., Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Fields, M. A. Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch’s Membrane. J. Vis. Exp. (134), e57084, doi:10.3791/57084 (2018).
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