Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света
Summary
Здесь мы представляем протокол для контролируемого производства белка микрокристаллов. Этот процесс использует автоматизированный устройство, позволяя контролируемых манипуляции нескольких параметров кристаллизации. Кристаллизации белка осуществляется добавлением контролируемых и автоматизированных кристаллизации растворов во время мониторинга и расследования радиус распределения частиц в кристаллизации капли.
Abstract
Устройство автоматического кристаллизации является запатентованная техника1 разработан специально для мониторинга белка кристаллизации эксперименты с целью точно маневр зарождения и роста кристаллов направлении желаемых размеров кристаллов белков. Контролируемой кристаллизации основана на образец расследования на месте динамического рассеяния света (DLS), в то время как все визуальные изменения в капли контролируются онлайн с помощью микроскопа, в сочетании с ПЗС-камеры, что позволяет полный Исследование протеина капель на всех этапах кристаллизации. Использование в situ DLS измерений на протяжении всего эксперимента позволяет более точное определение решения сильно пересыщенных белка, переходит на новый этап – формирование кристалл ядер. Путем определения стадии зарождения белка, кристаллизации могут быть оптимизированы от крупных белковых кристаллов для производства белковых микрокристаллов. Экспериментальный протокол показывает интерактивный кристаллизации, подход, основанный на точных автоматизированных шагов, таких как осадителя дополнение, испарение воды для вызывающих высокое Пересыщение, и разбавления образца для замедления индуцированной однородной нуклеации или вспять фазовых переходов.
Introduction
За последние несколько лет рост белков микро – и нанокристаллов привлекла к себе внимание сообщества белка кристаллография, особенно с непрерывное развитие серийный Фемтосекундный кристаллографии (SFX). Благодаря блеск Роман рентгеновского излучения источников и основанный на успешные результаты, полученные до настоящего времени, производство белков микро – и нанокристаллов стало большое значение, что создает высокий спрос на подготовку таких кристаллической суспензии 2 , 3. из-за небольшой кристалл размер диапазона, требуемого для сбора данных на свободных электронах лазеры (XFELs) и ограниченная доступность экспериментальной beamtime, характеристика образца до сбора данных имеет важное значение. Наиболее распространенные методы для того чтобы характеризовать микро – или Нанокристаллические суспензии белка являются до теперь электронной микроскопии и порошковой дифракции рентгеновских лучей.
До настоящего времени несколько подходов были адаптированы из общих методов кристаллизации с целью получения массового количества белковых кристаллов с размерами в диапазоне малых микрометра. Пакетный метод используется для быстрого смешивания высокой концентрации белка и осадителя решения, таким образом заставляя образец решения сильно пересыщенных фазу, где nanocrystallization может быть благоприятствования4. Другие методы включают в себя дробление крупных белковых кристаллов в форме суспензии кристалл, который может служить в качестве нанокристаллических суспензий, которые будут использоваться для сбора данных5. Однако результаты иногда может привести к снижению дифракционного качества, как ухудшение кристаллы имеют меньше внутреннего порядка. Nanocrystallization, основанный на свободный интерфейс диффузии альтернативен также доступны, где белок решение добавляется в небольших количествах в высококонцентрированных осадителя раствора3. Однако среди всех методов, наиболее эффективные методы, как представляется, быть пакетного кристаллизации и более инновационные манипулятивных техник, с использованием методов пара диффузии в сидя капель6.
В общем для кристаллизации белка необходимо пройти энергетического барьера для поддержки нуклеации – термодинамические первый шаг в формировании кристалла. В заказ переехать пересыщение раствора белка от термодинамически стабильного состояния и наконец навести фазового перехода, некоторые переменные, связанные с решением белков должны быть изменены. Такие переменные, как правило, концентрация раствора белка, экологические изменения (например., температура, влажность), растворителя характеристиками (например, pH, ионной силы), концентрации и буфера свойств, и т.д.7 ,8 обзор параметров выборки, которые могут быть изменены обычно представлены с помощью фазовых диаграмм, которые позволяют различные режимы представления, например диаграмм растворимости, нуклеации фасы диаграм или даже более подробные описания, где трехмерной или более сложных схем может вступить в рассмотрение8,9,10. Наиболее привлекательных видов фасы диаграм обычно двумерны, где главной переменной является концентрация белка как функции другого параметра, в то время как остальные параметры хранятся постоянные6,11. После того, как образуются одна или несколько ядер, более крупные кристаллы могут расти, поднимая дополнительного белка из массовых решения. При наведении на микро – и Нанокристаллические производства, такой подход обычных кристаллизации не возможно больше из-за небольшое количество кристаллов, которые присутствуют в растворе. Нанокристаллических суспензий обычно должны быть богатым в кристаллических образований, таким образом, что кристаллизации путь должен быть подрегулировано, таким образом, что есть Максима нуклеации событий в образце. Следовательно это требует расследования некоторых новых, до теперь неисследованных нуклеации пути для белков, которые также пока еще не полностью понял12,13. Основываясь на основы диаграмма фаза, упомянутых ранее, Классическая теория была распространена на новые гипотезы, где нуклеации описан как двухступенчатый механизм: во-первых, переход к более высокой концентрации белка имеет место (густая жидкость фаза) и во-вторых, переход от фазы плотной-богатые люди к выше внутреннего порядка (кристалл ядер с архитектурой решетки)14,,1516. Кристаллизации белка зависит от многих факторов, и поэтому при кристаллизации рецепты подрегулировано приведет к различных размеров кристаллов, нельзя всегда полагаться рецепты на предыдущих знаниях. Новые идеи должны быть созданы для каждой цели индивидуальных белков: Настройка буфера композиции, чистоты и стабильности образец, точное знание растворимость белков и т.д.
Динамическое рассеяние света является сегодня устоявшихся метод для анализа и оптимизации процессов кристаллизации белка, из-за широкий диапазон размеров частиц, которые могут быть исследованы: от мономерных белки нанокристаллов и малых микрокристаллов. Этот метод использует частиц в растворе проходят броуновского движения и что средняя скорость этого движения определяется размер частиц, их тепловой энергии и по вязкости среды и геометрии частиц. Во-первых жидкой среды загорана последовательной источник света с использованием лазера. Света, рассеянного частиц образуется интерференционной картины. Поскольку частицы находятся в постоянном движении интерференционной картины также меняется навсегда. При поиске в определенном направлении, могут наблюдаться колебания интенсивности. Эти колебания теперь показывают движение частиц, вызванные броуновского движения. От измеренной интенсивностью колебания вычисляется автокорреляционной функции (АКФ). Анализ АКФ даст мера распределения скорости (более точно коэффициент диффузии) частиц и используя уравнение Стокса-Эйнштейн, преобразуется в распределения частиц в радиус17. Дополнительную информацию, относящиеся к DLS функции и принцип работы можно найти в различных публикациях и книги18,19.
Здесь мы применяем и описать устройство уникальный автоматизированный кристаллизации, XtalController900, обновленной версии XtalController технологии6, точно разработана для мониторинга интерактивных белка кристаллизации экспериментов. Этот метод показывает высокий потенциал для идентификации и отслеживания нуклеации событий в режиме реального времени, позволяя точной маневрирования через кристаллизации фасы диаграм. Цель этой процедуры конкретного кристаллизации заключается в оптимизации кристаллизации белка для получения высококачественного белка микро – и нанокристаллов, подходят для приложений, используя микро сосредоточены синхротрона рентгеновских источников, дифракция электронов, или SFX.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кристаллизации устройство предназначено для контролировать и манипулировать важнейших параметров во время кристаллизации эксперимент, основанный на методе изменение пара диффузии. Этот метод позволяет мониторинга и забил эксперимент кристаллизации белка на всех этапах, позволяя пользователям иметь точные знания и управления раствора белка во всем кристаллизации фасы диаграм, основе в situ DLS анализ образца подвески.
Кристаллизации устройство включает в себя экспериментальные камеры (рис. 1) подключен к CCD камера, которая позволяет в реальном времени мониторинг капелька кристаллизации. Камера является адаптированы к микроскоп с различным увеличением линзы, обеспечивая максимальное пространственное разрешение примерно 2,5 мкм. Ядром экспериментальной камеры является сверхчувствительная микровзвешивания для отслеживания эволюции масса образца с течением времени. Процесс кристаллизации соответствует сидя капли пара диффузии эксперимент, где белок падение помещается на силиконизированной coverslip, который помещается на микровзвешивания. На основании изменений веса капли, которые вызваны осадителя сложения, добавлением воды/добавки или образец испарения, микровзвешивания дает точного вклад алгоритм для немедленного расчета концентрации белков и осадителя со временем . Кроме того важные кристаллизации такие параметры, как температура и относительная влажность точно контролируются и под контролем.
Чтобы выполнить эксперимент кристаллизации, устройство оснащено двух микро дозировка систем (контакт бесплатные пьезоэлектрический насосы), которые работают в масштабе пиколитр для добавления осадителя и воды. Работая с таким небольшим количеством вещества, градиенты концентрации и конвекции явление в рамках протеина капель сведены к минимуму. Основная роль пьезоэлектрический насосов является добавление осадителя или воды, последний для примера, используется в качестве компенсации за естественным испарение протеина капель. Микро дозировка системы имеют набор функций, которые могут диктовать добавлением вещества. Такие возможности включают: частота повторения для добавления вещества, количество капель добавил в секунду, ширина и высота вещество поток траектории, и т.д. Кроме того позиция насосов можно вручную отрегулировать, позволяя пользователю иметь точную позицию для добавления веществ в протеина капель.
Уникальный обратной связи контролируемых манипуляции каплю кристаллизации достигается в situ DLS данных, который может показать возможные изменения в состоянии олигомерных белка на протяжении всей экспериментальной процедуры. Методика позволяет постоянной оценки распределения частиц по размерам с течением времени, таким образом выявления неизвестных белков-механизмы. DLS оптика оборудование размещается стратегически ниже области coverslip, позволяя детектор и лазерный луч пройти через coverslip и далее через капли белка в моды в situ ; Таким образом из DLS пути записываются только изменения внутри капли. Чтобы разрешить легкой управляемостью, устройство имеет два отверстия: входная дверь для оптимального позиционирования coverslip и верхней крышкой, который может быть удален, так что пользователь может настроить съемки положение микро дозировка систем, а также установка с точностью новая dro белка plet на coverslip.
Метод интерактивный кристаллизации, с использованием вышеупомянутого устройства — это надежный метод контролируемые размер производства белковых кристаллов. Хотя в настоящее время доступны многие методы кристаллизации, внутри информация о кристаллизации сам механизм не легко достижимо. В целом применение обычных кристаллизации методов позволяет лишь ограниченный контроль решения в схеме фаза кристаллизации, с только несколько возможностей изменения ее курс после начала эксперимента. При выполнении кристаллизации экспериментировать и применения такой технологии автоматизированной кристаллизации, в сочетании с в situ DLS, большой получили знания о переходах в фасы диаграм. В целом регионы, аморфный осадок и индукции однородных нуклеации близки друг другу в фасы диаграм. Таким образом, манипулируя курс капельку кристаллизации, основанные на реальном времени информации о ее распределения частиц, это позволяет избежать осадков белок, постепенно регулируя кристаллизации условий к нуклеации и формирования кристалла.
В настоящее время многие кристаллизации условия включают осадителя решения, где широко присутствуют производных полиэтиленгликоля (PEG). Такие соединения, как правило, имеют высокую вязкость, которой может обладать трудности для пипетирования или выдачи. В настоящем тематическом исследовании микро дозировка систем, которые используются для подачи осадителя применяются очень тонкие капилляры, которые делают возможным добавление пл приращениями. Как следствие существуют некоторые ограничения в работе с высоко-вязких веществ. В течение ряда прошлых экспериментов, система дала положительные результаты, используя следующие производные PEG: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Хотя до настоящего времени были протестированы только вышеупомянутые решения, системы микро дозировка содержат специальный Отопление механизм, который может использоваться для того, чтобы снизить вязкость раствора. Еще одним фактором является солевых растворов, которые должны быть рассмотрены при использовании в качестве осадителя белка. При работе с высокой концентрацией соли, небольшое количество может кристаллизоваться в сопла системы микро дозировка, вызывая поверхностные блокирование микро дозировка насоса во время осадителя сложения; даже когда очень высокая относительная влажность воздуха присутствует в зале экспериментальной. Для преодоления этой проблемы, эксперимент должен быть отложена, так, что соль из сопла могут быть удалены. Это может потребовать специальной обработки и может производить ошибки на этапе осадителя сложения.
Основываясь на ценную информацию, которая может быть достигнута при выполнении таких автоматизированных кристаллизации экспериментов, этот метод может также распространяться на исследования, изучения аспектов физической химии белка кристаллизации. Нуклеации и кристалл реакции темпы роста являются кинетических явлений, которые могут быть получены и рассчитаны на основе информации зависимость от времени изображали из эксперимента например температуры, рост размера частиц, и белка и осадителя концентрация.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, что финансирование от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Мария Склодовская-Кюри акроним «X-Зонд» Грант соглашение № 637295 и поддержка через BMBF Грант 05K16GUA и «Гамбургский центр для сверхскоростной Imaging – структуры, динамики и контроль вопрос на атомной шкале» совершенство кластер Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- . . Patent “Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation”. , (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D’Amaré, A. R. . Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. . Dynamic light scattering: the method and some applications. , 978 (1993).
