גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור מבוקרת של חלבונים microcrystals. התהליך משתמש מכשיר אוטומטי המאפשר מניפולציה מבוקרת של מספר פרמטרים התגבשות. התגבשויות חלבון הוא נשא החוצה על ידי תוספת מבוקרת ואוטומטיים של התגבשות פתרונות תוך ניטור של חוקרים את רדיוס ההפצה של חלקיקי ה-droplet התגבשות.
Abstract
ההתקן התגבשות האוטומטי הוא פטנט1 שפותחה במיוחד עבור ניטור חלבון התגבשות ניסוייו לתמרן בדיוק את התגרענות ואת הצמיחה קריסטל לכיוון הרצוי בגדלים של גבישי החלבון. התגבשויות מבוקרת מבוסס על מדגם חקירה עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי (DLS) בעוד כל השינויים החזותיים ה-droplet מנוטרים באינטרנט בעזרת מיקרוסקופ מצמידים מצלמה CCD, ובכך מאפשר מלא חקירת ה-droplet חלבון בכל שלבי התגבשות. השימוש בבאתרו DLS מדידות לאורך כל הניסוי כולו מאפשרת זיהוי מדויק של הפתרון חלבון מאוד supersaturated מעבר לשלב חדש – היווצרות של התגבשות. על ידי זיהוי שלב התגרענות חלבון, התגבשויות ניתן למטב מקריסטלים חלבון גדולה לייצור של חלבונים microcrystals. פרוטוקול הניסוי מראה התגבשות אינטראקטיבי גישה המבוססת על צעדים מדוייקים אוטומטיות כגון תוספת precipitant, אידוי מים עבור בתדר גבוה רוויית יתר, מדגם דילול על האטה המושרה התגרענות הומוגניות או היפוך פאזה מעברים.
Introduction
במהלך השנים האחרונות, הצמיחה של חלבון מיקרו – nanocrystals לכד את תשומת הלב של הקהילה חלבון-קריסטלוגרפיה, במיוחד עם פיתוח מתמשך של קריסטלוגרפיה בפמטושניות טורי (SFX). בשל הברק של הרנטגן הרומן קרינה ממקורות, בהתבסס על תוצאות מוצלחות שהושגו עד כה, הייצור של חלבון מיקרו, nanocrystals הפך רלוונטיות גבוהה, התחזות ביקוש גבוה על הכנת כזאת השעיות גבישי 2 , 3. עקב קריסטל קטנים בגודל-הטווח הדרושים עבור איסוף נתונים-לייזר אלקטרונים חופשיים (XFELs), המוגבל של beamtime ניסיוני, לדוגמה האפיון לפני איסוף נתונים הוא חיוני. הטכניקות הנפוצות ביותר לאפיון המתלים מיקרו – או nanocrystal חלבון הם עד עכשיו מיקרוסקופ אלקטרוני ו רנטגן אבקת עקיפה.
עד כה, מספר גישות כבר הסתגלו שיטות נפוצות התגבשות במטרה לייצר כמויות בכמות גדולה של חלבון קריסטלים עם ממדים בטווח קטן מיקרומטר. השיטה אצווה משמש עבור ערבוב מהיר של חלבון מרוכז ופתרונות precipitant, ובכך לאלץ את הפתרון הדגימה עד שלב מאוד supersaturated איפה nanocrystallization יכול להיות המועדף4. שיטות אחרות כוללות ריסוק חלבון גדולה גבישים כדי ליצור של slurry קריסטל, אשר יכול לשמש תכונות המתלים יש להשתמש עבור אוסף נתוני5. עם זאת, התוצאה עלולה לפעמים לגרום עקיפה ירידה באיכות, כפי הורע לקריסטלים לסדר הפנימי התחתון. Nanocrystallization מבוסס על ממשק חינם דיפוזיה היא גם אלטרנטיבה זמינה, איפה חלבון פתרון נוסף בכמויות קטנות פתרון precipitant מרוכז3. עם זאת, בקרב כל טכניקות, השיטה היעילה ביותר להיראות התגבשויות אצווה, טכניקות חדשניות מניפולטיבית יותר בשיטות אדי דיפוזיה כשהם יושבים טיפות6.
באופן כללי, עבור התגבשות של חלבון חייב חצה מחסום אנרגיה כדי לתמוך התגרענות – הצעד הראשון תרמודינמי במבנה הגביש. כדי להעביר את הפתרון חלבון מדינה יציבה למה רוויית יתר, סוף סוף לזירוז מעבר פאזה, משתנים מסוימים הקשורים הפתרון חלבון צריך להיות שונה. משתנים כגון בדרך כלל הריכוז של הפתרון חלבון, שינויים סביבתיים (למשל., טמפרטורה, לחות), מאפייני הממס (למשל, pH, כוח יונית), ריכוז ומאגר נכסים, וכו7 ,8 סקירה כללית של פרמטרים דוגמת אשר ניתן לשנות מיוצגת בדרך כלל באמצעות דיאגרמות שלב, אשר מאפשרים מצבים שונים של המצגת, כגון מסיסות דיאגרמות, דיאגרמות שלב התגרענות או אפילו יותר מפורט תיאורים איפה דיאגרמות תלת-ממדי או מורכבים יותר יכולים להיכנס שיקול8,9,10. סוגי דיאגרמות שלב היפה ביותר הם בדרך כלל דו מימדי, שם המשתנה העיקרי הוא ריכוז חלבון כפונקציה של פרמטר אחר, ואילו שאר הפרמטרים נשמרים קבועים6,11. ברגע אחד או כמה גרעינים נוצרים, גבישים גדולים יותר יכול לגדול על ידי לקיחת טיפול חלבונים נוספים מהפתרון בצובר. כאשר מכוון לייצור מיקרו – ו nanocrystal, כזה בגישה המקובלת התגבשות הוא לא ריאלי יותר עקב מספר קטן של בעלי ההווה בפתרון. תכונות המתלים בדרך כלל צריכה להיות עשירה הישויות גבישי, ובכך שמסלול התגבשות חייב להיות והשתלב, כך יש מקסימה של אירועים התגרענות נוכח במדגם. כתוצאה מכך, זה דורש החקירה של חלק חדש, עד עכשיו נחקרו התגרענות מסלולים עבור חלבונים, המהווה גם עדיין לא לגמרי מובן12,13. בהתבסס על היסודות תרשים שלב שהוזכר קודם לכן, התיאוריה הקלאסית הורחבה השערה חדשה, שבה התגרענות מתואר כמנגנון בשני שלבים: בשלב הראשון מעבר ריכוז חלבון גבוה יותר מתקיים (צפיפות הנוזל שלב) ושנית, מעבר בין שלב צפוף עשיר גבוה יותר לסדר הפנימי (התגבשות האדריכלות סריג)14,15,16. חלבון התגבשות רגישים לגורמים רבים, ולכן בעת התגבשות מתכונים הם והשתלב לגרום גבישים בגדלים שונים, המתכונים תמיד לסמוך על הידע הקודם. תובנות חדשות צריך שתוקם עבור כל מטרה חלבונים בודדים: התאמה של מאגר הרכב, טוהר, יציבות של הידע דוגמה, מדויקת של מסיסות חלבון, וכו ‘.
פיזור אור דינאמי הוא היום שיטה ומבוססת על ניתוח ואופטימיזציה של תהליכים התגבשות חלבון, בשל גודל-מגוון רחב של חלקיקים יכול ייחקרו: של חלבונים monomeric nanocrystals, microcrystals קטן. השיטה מנצלת חלקיקים בתמיסה עוברים תנועה בראונית, כי המהירות הממוצעת של תנועה זו נקבע לפי גודל החלקיקים, אנרגיה תרמית שלהם ולפי צמיגות של המדיום, את הגיאומטריה של חלקיק. בהתחלה, המדיום הנוזלי מואר על ידי מקור אור קוהרנטי עם השימוש של לייזר. האור מפוזר על ידי חלקיקים היא יצירת תבנית של התאבכות. כי החלקיקים נמצאים בתנועה קבועה תבנית ההתאבכות משנה גם לצמיתות. כאשר מסתכלים בכיוון מסוים, יכול להיות שנצפו עוצמת תנודות. תנודות אלה מוצגים כעת את תנועת החלקיקים הנגרמת על ידי תנועה בראונית. מפני תנודות נמדד בעוצמה תפקיד autocorrelation (ACF) מחושבת. ניתוח של ACF ייתן מדד להתפלגות מהירות (ליתר דיוק את מקדם דיפוזיה) של חלקיקים, באמצעות המשוואה סטוקס-איינשטיין, מומר חלקיקים רדיוס ההפצה17. מידע נוסף הקשור DLS פונקציונליות, עקרון הפעולה ניתן למצוא פרסומים שונים, ספרים18,19.
כאן נוכל להחיל. ומתארות מכשיר ייחודי התגבשות אוטומטיות, XtalController900, גרסה משודרגת של XtalController טכנולוגיה6, בדיוק שפותחו עבור ניטור ניסויים התגבשות חלבון אינטראקטיבי. טכניקה זו פוטנציאל זיהוי, מעקב אחר האירועים התגרענות בזמן אמת, המאפשר תמרון מדויקת באמצעות הדיאגרמה בשלב התגבשות גבוה. המטרה של הליך מסוים התגבשות היא לייעל את התגבשות חלבון כדי להשיג איכות גבוהה חלבון מיקרו – nanocrystals המתאימים עבור יישומים המנצלים מקורות synchrotron ממוקדות מיקרו רנטגן, אלקטרון עקיפה, או SFX.
Protocol
Representative Results
Discussion
המכשיר התגבשות נועד לפקח ולטפל פרמטרים קריטיים במהלך ניסוי התגבשות המבוסס על שיטה אדי דיפוזיה שונה. טכניקה זו מאפשרת מעקב וניקוד ניסוי התגבשות חלבון בכל שלביו, המאפשר למשתמש יש ידע מדויק ושליטה של הפתרון חלבון לאורך כל הדיאגרמה בשלב התגבשות, בהתבסס על בחיי עיר ניתוח DLS של ההשעיה הדגימה.
המכשיר התגבשות כוללת חדר ניסיוני (איור 1) מחוברת מצלמת CCD המאפשר ניטור בזמן אמת של ה-droplet התגבשות. המצלמה הוא מותאם מיקרוסקופ מצויד עם עדשות שונות הגדלה, המספק רזולוציה מרחבית מקסימלי של 2.5 מיקרומטר. הליבה של התא ניסיוני הוא microbalance העדינה למעקב אחר ההתפתחות של המשקל מדגם לאורך זמן. ההליך התגבשות מקביל ניסוי ישיבה-שחרור קיטור דיפוזיה, איפה הירידה חלבון מושם על coverslip siliconized, אשר ממוקם על microbalance. בהתבסס על שינויים במשקל של ה-droplet, אשר נגרמות על-ידי precipitant, תוספת מים/תוסף או מדגם אידוי, microbalance נותן קלט מדויקים כדי אלגוריתם לחישוב מיידית של ריכוז חלבון ו precipitant לאורך זמן . בנוסף, חשוב התגבשות פרמטרים כגון טמפרטורה, לחות יחסית בדיוק תחת פיקוח, מבוקר.
על מנת לבצע ניסוי התגבשות, המכשיר מצויד עם מערכות המיקרו-מינון שני (לפנות משאבות פיזואלקטריים חינם) שעובדים בקנה מידה picoliter עבור תוספת precipitant ומים. על ידי עובד עם כאלה כמויות קטנות של החומר, מעברי הצבע ריכוז והתופעה הולכת חום בתוך ה-droplet חלבון הן מזעריות. התפקיד העיקרי של משאבות פיזואלקטריים הוא התוספת של precipitant או מים, שהאחרון למשל בשימוש כמו פיצוי אידוי טבעי של חלבון ה-droplet. מערכת המיקרו-מינון יש קבוצה של תכונות, אשר יכולה להכתיב התוספת של חומר. כוללות תכונות כגון: שיעור החזרה עבור הוספת חומר, מספר טיפות הוסיף לכל שניה, את הרוחב והגובה מסלול זרם החומר, וכו ‘. יתר על כן, המיקום של המשאבות ניתן להתאימם באופן ידני, המאפשר למשתמש יש מיקום מדויק עבור תוספת של חומרים לתוך חלבון ה-droplet.
מניפולציה משוב ייחודית נשלט של הטיפה התגבשות מושגת על ידי בחיי עיר DLS נתונים, אשר יכול להציג שינויים אפשריים במדינה oligomeric חלבון לאורך כל תהליך ניסיוני. הטכניקה מאפשרת הערכה קבועה של פילוג גודל החלקיקים לאורך זמן, לכן חשיפת המנגנונים הקשורים חלבון לא ידוע. ציוד אופטיקה DLS ממוקם אסטרטגית מתחת השטח coverslip, המאפשר את קרן גלאי ולייזר לקרב עוברים coverslip דרך ה-droplet חלבון באופן בחיי עיר ; לכן, רק שינויים בתוך ה-droplet נרשמים מהנתיב DLS. כדי לאפשר טיפול קל, למכשיר יש שני פתחים: דלת כניסה מיקום אופטימלי בין coverslip את המכסה העליון אשר ניתן להסירו, כך המשתמש יכול לשנות את עמדת הירי של מערכות מיקרו-המינון כמו גם הגדרת עם דיוק של dro חלבון חדש plet-coverslip.
השיטה התגבשות אינטראקטיבית באמצעות המכשיר הנ ל היא טכניקה אמין לייצור שבשליטת בגודל של חלבון קריסטלים. למרות שיטות התגבשות רבות זמין כעת, בתוך מידע אודות התגבשויות מנגנון עצמו הוא לא בר השגה בקלות. באופן כללי, יישום שיטות קונבנציונליות התגבשות מאפשר בקרה מוגבלת בלבד פתרון בדיאגרמה בשלב התגבשות, עם רק כמה אפשרויות של שינוי מסלולו ברגע ניסוי החלה. תוך כדי ביצוע התגבשות של הניסוי, החלת כזה של התגבשות אוטומטית עם טכנולוגיית מצמידים בחיי עיר DLS, נהדר הידע מתווסף על מעברים בדיאגרמה שלב. באופן כללי, האזורים וכתוצאה מכך התמיסה אמורפי של אינדוקציה של הומוגניות התגרענות הם קרובים אחד לשני בדיאגרמה שלב. על-ידי מניפולציה הקורס של droplet התגבשות בהתבסס על מידע בזמן אמת על תפוצתו של חלקיקים, לכן ניתן למנוע משקעים של חלבון באמצעות בהדרגה התאמת התנאים התגבשות לכיוון התגרענות ו קריסטל-צורה.
כיום, תנאים התגבשות רבים כוללים precipitant פתרונות היכן פוליאתילן גליקול (PEG) נגזרים נוכחים באופן נרחב. תרכובות כאלה יש בדרך כלל של צמיגות גבוהה אשר שיכולה להיות קשיים pipetting או מחלק. במקרה שלפנינו, להחיל מערכות המיקרו-מינון המשמשות מחלק precipitant נימים דקיקים שהופכים את התוספת של picolitre במרווחים אפשרי. כתוצאה מכך, ישנן כמה מגבלות בעבודה עם חומרים בעלי צמיגות גבוהה. בתוך סדרה של ניסויים קודמים, המערכת נתן תוצאות חיוביות באמצעות של derivates פג הבאים: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. למרות כה נבדקו רק הפתרונות הנ ל, מערכות המיקרו-מינון מכילות מנגנון חימום מיוחד אשר יכול לשמש כדי להפחית את צמיגות של פתרון. גורם נוסף הוא פתרונות מלח צריך להיחשב כאשר הוא משמש חלבון precipitant. בעת עבודה עם מלחי מרוכז, כמות קטנה יכולה להתגבש על הצינור של מערכת המיקרו-מינון, גורם חוסם שטחית של המשאבה המיקרו-מינון במהלך הוספת precipitant; גם כאשר הלחות היחסית גבוהה מאוד מציגים בבית הבליעה ניסיוני. כדי להתגבר על בעיה זו, הניסוי צריך יצתרך לחכות כך שניתן יהיה להסיר את המלח מן הצינור. זה עשוי לדרוש טיפול מיוחד, עשוי לייצר שגיאות בשלב בנוסף precipitant.
בהתבסס על מידע בעל ערך ניתן להשיג בעת ביצוע ניסויים אלה התגבשות אוטומטיות, טכניקה זו גם ניתן להרחיב מחקרים חוקרת את ההיבטים כימיה פיזיקלית של התגבשות חלבון. שיעורי התגובה צמיחה התגרענות וקריסטל תופעות קינטי אשר ניתן לגזור מחושב על בסיס המידע זמן-התלות מתואר ניסוי כגון טמפרטורה, הצמיחה של גודל החלקיקים, חלבון ו- precipitant ריכוז.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים לאשר מימון של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר, חדשנות תוכנית תחת מארי קירי Sklodowska ראשי תיבות “X-בדיקה” גרנט הסכם מס 637295 ותמיכה באמצעות BMBF גרנט 05K16GUA, ולא את “המבורג מרכז עבור מרביים הדמיה – מבנה, דינמיקה, שליטה של החומר את המשקל האטומי”מצוינות האשכול פתוח דויטשה (DFG).
Materials
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- . . Patent “Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation”. , (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D’Amaré, A. R. . Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. . Dynamic light scattering: the method and some applications. , 978 (1993).
