血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナ ミックスを定量化します。

1. 準備 培養内皮細胞のコロニー形成細胞 (ECFCs)注: これらの実験で使用される胎児 ECFC サンプルされた臍帯血から分離したし、前述6としてインディアナ大学医学部でアンギオ ビアコア (ABC) で培養します。前述の19,20,21として内皮細胞抗原の発現を確認する ABC 内で日常の品質管理の表現型解析を行った。サンプルで実験使用された最小継代 (2-3 回)。ティッシュ文化フードのすべての培養作業を行った。組織培養プレートとソリューションを含むすべての試薬が滅菌されました。 2 日前の実験では, 100 mm 6 ml 0.05 mg/mL タイプ 1 コラーゲンの組織培養プレート丸棒をコート、37 ° C で一晩インキュベートします。注: タイプ 1 コラーゲンは 0.05 mg/mL の作業濃度に 20 nM の酢酸を含む二重蒸留水で希釈しました。 実験では, 前日の trypsinize し、1.1.1 でタイプ 1 コラーゲンをコーティングしたプレートに ECFCs を replate します。(ご注意下 1.1)。 ECFCs を trypsinize、めっきされたセルからメディアを吸引し、7 mL の PBS で洗浄します。PBS を吸引し、0.5% トリプシンの 2-3 mL を追加し、37 ° C で 2-5 分のための細胞を孵化させなさい トリプシン、インキュベーションの直後に、EGM2 とピペットを上下すべての付着性細胞を取り除くための 3 mL を追加します。細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。 室温で 5 分間 500 x g ですべてのサンプルを遠心します。 上清を吸引し、再 EGM2 の 1-2 mL の細胞ペレットを中断します。細胞懸濁液を混和し、カウントのための小さい因数 (20-40 μ L) を削除します。 因数のセルに等しい部品トリパン ブルーを追加し、診断に 10 μ L をピペットします。検定の主な 4 つの象限内のセルの数をカウントします。注: は、精度を高めるためすべてのサンプル数の検定の両側を使用します。 1.1.1 7 mL の PBS で 2 回のステップで準備されたコラーゲン塗布培養プレートを洗います。内皮細胞成長培地 2 (EGM2) 10 mL を追加、2 番目の PBS 洗浄後培地プレートに 10% 牛胎児血清の文化. 1.1.7 の手順で、セル数を用いて、プレート 4 x 105セルに必要な細胞懸濁液の量を計算します。プレート 4 x 105 ECFCs 組織培養プレート上 1.1.8 の手順で準備し、37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO2) 一晩インキュベートします。 実験前に保存用品では 4 °C の一夜 3″× 2″ の金属プレート、スライド (フードで開くまでパッケージしてください)、滅菌 20 1 マイクロリットル (μ L) のヒント、および基底膜マトリックス (行列) のボックスを保存します。注: マトリックスは長期的なストレージの-80 ° C に保たれて一晩、またはいくつかの時間を使用する前に常に 4 ° C でそれを解凍します。 コンピューターのハード ドライブ上の画像のための十分な容量の可用性を確認します。注: は、この議定書に記載されている構成を使用して、約 60 ギガバイト (GB) 容量の実験 (4 GB/ウェル) あたり必要があります。ただし、容量の見積もりはハードウェア構成に基づいています、システムごとに決定する必要があります。 2. プロトコル 1: 実験装置: スライドの準備 収集し、供給を準備 実験の日は、氷、ドライアイスの小さい容器、はさみ、20 μ L ピペットのバケットを含むスライドのセルをメッキの消耗品を収集します。すべてのアイテムを 70% エタノール スプレー、ペーパー タオルで拭いて乾かして、滅菌のティッシュ文化フードにアイテムを配置します。 4 ° C で保存すべての消耗品を収集 (ステップ 1.2 参照) 金属板、ヒント、スライド、およびマトリックスのボックスを含みます。ヒントのボックスを 70% エタノール スプレーし、ドライアイスのコンテナーにボックスを配置します。注: 削除行列から 4 ° C の冷蔵庫を使用して氷の行列は常に準備ができている場合にのみ。 70% エタノールに金属板をスプレー、氷のバケツに氷に埋め込むこと。スライドを含むパッケージを開き、それを冷たい保つために金属板にスライドを配置します。 負荷行列をスライドに 10 μ L をピペットを設定し、ピペットとコールド チップ ボックスからヒントを削除します。はさみで先端の端から約 1 cm を切る。注: マトリックス中の気泡を抑えるヒントに垂直カット。ピペット設定できますボリュームに先端の内側に付着するマトリックスを考慮する 10 μ L よりも若干大きい。 ゆっくりピペット チップにマトリックスを描画します。井戸の中心にピペット チップをすぐに配置します。井戸の底にピペット チップをそっと触れるし、ゆっくりと行列を押し出します。注: はないピペット、以上これ原因になりますフォームに泡。バブル形成された場合はすぐに小ねたを使用してポップします。 スライドには、15 の個々 の井戸が含まれています。各井戸の前の手順を繰り返します。一貫性を維持し、先端内部固化行列を減らす各ウェルの新しいピペット チップを使用します。 マトリックスを含むすべての井戸でスライドが読み込まれると、スライドにふたを押すし、マトリックスが固化するまでに 30-60 分の 37 ° C で孵化させなさい。注: 乾くマトリックスをてはいけないです。PBS のマトリックスの乾燥のリスクを軽減するインキュベーターでスライドの近く 50 mL コニカル チューブのキャップに少量 (2-3 mL) を追加します。 3. プロトコル 2: めっきマトリックスの ECFCs 組織培養皿から付着 ECFCs を外し、懸濁液の収集 組織培養プレート、ECFCs を含むメッキ前の日 (セクション 1.1.9 参照) を取得します。EGM2 メディアを吸引し、付着 ECFCs 7 mL の PBS で 1 回洗浄します。 PBS を吸引、トリプシンの 2-3 mL を追加し、37 ° C で 2-5 分の付着性のセルを孵化させなさい インキュベーションの直後に、EGM2 とピペットを上下すべての付着性細胞を取り除くための 3 mL を追加します。細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。 懸濁液のすべての 4 つのセルのサンプルが収集されるまで残り 3 つ ECFC サンプルの手順 3.1.1-3.1.3 を繰り返します。 マスター ミックスを準備します。 室温で 5 分間 500 x g ですべてのサンプルを遠心します。 上清を吸引し、再 EGM2 の 1-2 mL の細胞ペレットを中断します。 細胞懸濁液を混和し、カウントのための小さい因数 (20-40 μ L) を削除します。 因数のセルに等しい部品トリパン ブルーを追加し、診断に 10 μ L をピペットします。検定の主な 4 つの象限内のセルの数をカウントします。注: は、精度を高めるためすべてのサンプル数の検定の両側を使用します。 上から数えるセルを使用して、1.4×104セルが含まれている各セルのサンプル量を計算します。すべての細胞懸濁液を混和、実験条件ごとにマスター ミックスを調製する新鮮なチューブに 10 の4セル分注 1.4。EGM2 メディアを追加すると、各マスター ミックスの最終巻、175 μ L。 スライド上の個々 の井戸にマスター ミックスの軽くピペッティングと分注 50 μ l 各マスター ミックスをミックスします。注: すべてのサンプルを 3 井戸の十分な量を確保するため 3.5 井戸の計算マスター ミックスと 3 通、めっき。 スライドを孵化させなさい イメージングのための顕微鏡室に移動できるまでは、37 ° C でスライドを孵化させなさい。注: めっきおよびイメージ投射の間の時間は血管の初期段階中にデータの損失を制限する限り簡単にはずです。 4. プロトコル 3: 顕微鏡のセットアップと画像の取得 注: 我々 の研究プロトコル 2 と 3 によって実施された同時に別々 の個人。プロトコル 2 と 3 は、同じ個人によって完了する必要があります、プロトコル 3 手順 4.1 と 4.2 以下上記プロトコル 2 を開始する前に完了する必要があります。 顕微鏡とコンピューターをオンに 実験を開始する前に約 1 〜 2 時間を入れますと 37 ° c ステージ トップ インキュベーターを予熱、CO2を 5% に設定し、湿度を 85% に設定。空の場合は、インキュベーターの湿度貯蔵所を入力します。 1 つ、2 つのオープン ポジションの空腔症スライドを置き、蒸留水で埋めます。利用可能な場合は、室内温度制御のフィードバックの温度計を保護します。注: フィードバックの温度計が利用可能な場合、使用してこの「インキュベーター温度」商工会議所が平衡するいることを確認しますします。 二次送風機のスライドを下から加熱すると結露を最小限に抑える 39-42 ° C に設定をオンにします。 実験のスライドを追加することができますまで、空白として 2 番目のスライドを追加します。このスライドは、セットアップ中に個々 の井戸の画像集録設定の構成の場所のプレース ホルダーとして機能します。 イメージングの実験中に条件を模倣する 2 番目のスライドに井戸を囲む貯水池に水を追加します。周辺の井戸水は、顕微鏡のセットアップと予熱の間に湿度の評価できます。注: ステージ上のインキュベーターと二次送風機の前の平衡安定した培養環境を維持するために重要です。ほとんど生細胞室内コント ローラーは、2、およびシステムの準備状況を評価するために湿度、温度、CO のリアルタイムのフィードバックを与えます。続行する前にスライドの湿気の蓄積と 4.1.5 満たされて、貯留層の過剰な乾燥をチェックします。湿度は、過剰な乾燥や室内の結露がある場合に調整する必要があります。湿度を上げるには、蒸留水で湿ったワイプを追加します。結露を減らすには、4.1.1 で調整、湿度の設定を減少または凝縮低温の徴候である可能性があります、室内温度設定し、二次送風機の位置決めを確認します。 平衡の中に基本的な画像の取得設定を構成します。注: 画像は、ステージ、シャッター、およびカメラ制御ソフトウェアで構成されます。多次元セットアップ ツールは、ソフトウェアを構成する最も簡単な方法です。さらに、ソフトウェアは、オート フォーカス フォーカス制御実験の期間を確保するためのルーチンを持っている必要があります。 ソフトウェアを使用すると、各ウェルの複数の段階の位置を設定します。このプロトコルでは、井戸のセンターを選択します。 各ステージ位置でよく全体がイメージは、画像集録を構成します。たとえば、10-20% 画像重複とカメラと最終倍率に応じて、約 5 × 5 のフィールド、tilescan を使用します。 15 分毎のイメージングのための時間の経過を構成します。注: は、この議定書に記載されている構成を使用して、スライドのすべての 15 の井戸は 15 分間隔内で作成されます。 実験のスライドをロードします。 次のインキュベーター室の平衡、白紙のスライドを実験のスライドに置き換えます。注: 安定した温度、CO2、および少なくとも 20 分湿度釣合いの商工会議所があります。実験的スライド準備ができたら、手順が完了しているすぐに「死んだ時間」を最小限に抑えるためめっきと顕微鏡で撮影した最初の時点が不可欠です。さらに、イメージング実験の比較を容易にするために今回は一貫しているべきです。これらの実験プロトコル 3 セクション 4.3 で概説したすべての手順を完了する約 30 分が必要。 スライド蓋を削除し、スライドに井戸を囲む貯水池に水を追加します。注: 蓋を外してイメージング実験の持続期間のため。 最終的なイメージの取得の設定を構成します。 CFI 計画蛍光 DL 10 × 対物を所定の位置にし、コンデンサーの Ph1 位相リングを選択します。フォーカスの最初の井戸、ケーラー照明用透過光パスの調整し、客観的位相マスクのコンデンサーの位相リングの配置をチェックすることによって位相光学系を構成します。 露光時間を構成し、位相コントラストは、500 ms 以下は、通常のランプの明るさを調整します。 4.2.1 で各ステージの位置の設定を循環し、必要に応じて井戸の中心が選択されていると、それを調整することを確認します。 各ステージ位置で井戸のメッキおよびイメージング ソフトウェアの使用ステージ位置の z 位置を設定のセルに焦点を当てます。 顕微鏡用オート フォーカス機構をテストします。オート フォーカスがハードウェア ベースの場合にあり、すべての段階の位置の位置が正しくを確認します。注: 標本やステージは、実験中に垂直方向にドリフトが、ソフトウェアが各ステージの位置と時間コース中に信頼性の高い画像を確保するためのすべての時点でオート フォーカスをチェックすることが重要です。可能であれば、以前の時点で決定したオート フォーカスの位置は、その後オート フォーカス ルーチンの開始点として使用ください。この方法にドリフトすることができます調整の簡単。 削減または顕微鏡部屋の照明を消すし、イメージングの実験を開始します。 5. プロトコル 4: 画像の血管 (KAV) の処理・動力学的解析 各ウェルの画像のスタックとして個々 の時点から画像を保存します。注:イメージをキャプチャするほとんどのソフトウェアは、時系列のマルチページ tiff (スタック) をエクスポートできます。KAV は、複数時間ポイントを含むデータセット上で動作する設計されています。したがって、分析は、与えられたステージ位置の全体画像のスタックで発生します。必要な場合、画像処理ソフトウェアは、画像のスタックを再構築するには、各時間ポイントから単一イメージをインポートできます。 画像処理、コンピューター上のソフトウェアを開く 画像処理ソフトに KAV を追加します。 KAV ファイルをフォルダーからソフトウェアのウィンドウの下部に灰色のバーにドラッグします。一覧にソフトウェアを追加して「保存」をクリックします。 分析対象とする画像のスタックを開く クリックして ‘ファイル’、” 画像処理ソフトウェア、またはステップ 5.3.1 のように灰色のバーにドラッグ イメージ ファイルのドロップダウン メニューを開きます。 ‘画像’、’Type’、’8 bit’ をクリックして、画像を 8 ビットに変換します。 利益 (率 ROI) の領域を作成します。 [分析] をクリックしてツール バーで ROI マネージャーを開きます。’ツール’ ‘ROI マネージャー’ によってを選択します。 新しい投資収益率を作成するには、ツールバーの円または四角形の選択ツールをクリックし、画像を選択領域の描画します。その図形を保存する ROI マネージャー] ウィンドウで「追加」をクリックします。注: 以前に作成した投資収益率は、保存・ ロワ (圧縮フォルダー) をドラッグしてマネージャーで開く ‘ドラッグ アンド ドロップ’ バーに開くことができます。 画像での表示に ROI マネージャーに表示される ROI のラベルをクリックします。注: 投資収益率は、画像に表示されません、2 番目の ROI (任意のサイズ/形状) を作成し、マネージャーに追加します。両方を前後 2 つのクリックして・ ロワは、リストに表示され、目的の投資収益率は、画像に表示されます。 必要な場合は、投資収益率を合わせます。投資収益率は、目的の場所にイメージ上には、一度メニューに移動し、’編集’、’ 明確な外 ‘ をクリックします。これは、スタック内の各イメージの投資収益率 (非長方形の図形に便利) 外部画像データが削除されます。注: 矩形形状の投資収益率を使用している場合、’画像’、’収穫’ をクリックしてまた。 KAV ソフトウェアを実行します。 メニュー バーの ‘プラグイン’ をクリックします。 分析ネットワーク選択プラグイン。プラグインの設定を変更するオプションを含むウィンドウが表示されます。 ドロップダウン矢印を使用してしきい値選定法を変更します。 すべての適切な設定を選択すると、ソフトウェアの処理を開始する [OK] をクリックします。注: 適切な設定は、識別し、細胞および位相コントラストの背景からネットワークを識別するソフトウェアの精度の指標である KAV、によって生成されたスケルトンとマスク レンディションの可視化によって決定されます。 KAV で生成されたデータを保存します。 プラグインは、解析が完了すると 2 つのウィンドウが数値とスケルトンとマスクのレンディションを描いた融合画像のスタックのデータ テーブルを含む画面にポップアップされます。 データ テーブルの左上隅に移動して数値を保存し、クリックすると ‘編集’、’コピー’ または ‘カット’ excel スプレッドシートに値を貼り付けます。 融合スケルトンとマスク画像をクリックします。ファイルをクリックして ‘、’ ‘ Save As’ ‘TIFF’ タグ付きイメージ ファイルの形式 (TIFF) ファイルとして融合スケルトン/マスク画像のスタックを保存します。 トリミングの位相を保存 ‘ファイル’ ‘ Save As’ ‘TIFF’ をクリックして画像のスタック (ROI を使って作成) ROI マネージャー ウィンドウをクリックし、画像をトリミングに使用される投資収益率を選択します。将来の使用のための ROI を保存する ‘保存’ に続いて ‘より’ をクリックします。注: は同じ ROI を使用して解析一貫性を保つ役立ちます。