Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado

La capacidad de cultivar células de ratones o criptas humanas como organoides tridimensionales (3D) desde el intestino delgado o el colon durante períodos de tiempo prolongados proporcionó un gran avance porque estos cultivos muestran características definitorias del epitelio intestinal in vivo ^{1 , 2 , 3}. Los organoides derivados de las criptas primarias son capaces de auto-renovación y auto-organización, exhibiendo funciones celulares similares a sus tejidos de origen. De hecho, los organoides recapitulan no sólo la organización estructural de las criptas in vivo, sino también muchas características moleculares, proporcionando así herramientas útiles para estudiar la biología normal y los estados de enfermedad. Para ilustrar, estudios organoides han revelado nuevas vías moleculares implicadas en la regeneración tisular^1,2,3,4,5 así como fármacos que podrían mejorar la función en ajustes patológicos^6,7.

El estudio de las células madre intestinales es de particular interés porque el revestimiento intestinal se encuentra entre los tejidos de mamíferos más altamente regenerativos, renovándose cada 3-5 días para proteger el organismo de bacterias, toxinas y otros patógenos dentro de la lúmenes intestinales. Las células madre intestinales (ISC) son responsables de esta notable capacidad regenerativa y por lo tanto proporcionan un paradigma único para el estudio de la función de células madre adultas^1,2. Los experimentos de trazado de linaje en ratones demostraron que se pueden cultivar células madre aisladas lgr5 positivas para generar organoides 3D o “mini-guts” in vitro donde reflejan de cerca sus contrapartes in vivo. Los cultivos organoides también pueden derivarse de aislados celulares de cripta intestinal compuestos por progenitores, ISC y células Depanet, los cuales constituyen las células de nicho epitelial in vivo. De hecho, el cultivo organoide a partir de células de cripta intestinal primaria ha evolucionado hasta convertirse en una técnica relativamente rutinaria que es fácil de implementar en la mayoría de los laboratorios utilizando reactivos ampliamente disponibles. Este modelo también es susceptible al análisis cuantitativo de la expresión génica mediante la secuenciación de ARN (RNA-Seq) y proteínas por espectrometría de masas, inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente^2,4,8. Además, la genética funcional se puede estudiar utilizando enfoques de ganancia de función (sobreexpresión genética o expresión de un gen mutante activador) o pérdida de función (silenciamiento del gen o expresión de un mutante de pérdida de función)².

Es importante destacar que la baja eficiencia y la alta toxicidad del ADN plásmido estándar o los protocolos de transducción viral con polibrino siguen siendo un obstáculo importante en el campo. Aunque la tecnología CRISPR/Cas9 permite una edición precisa del genoma, este enfoque requiere una selección que requiere mucho tiempo seguida de la validación de secuencia^s9. Aquí, presentamos un protocolo de transducción viral para organoides intestinales primarios que optimiza la entrega de partículas virales por conjugación a nanopartículas magnéticas y aplicación de un campo magnético. Se proporcionan modificaciones clave a los protocolos anteriores^{4,5,10,11,12,13} y recomendaciones para mejorar la eficiencia. También describimos un enfoque para generar secciones congeladas a partir de organoides intactos cultivados en matrigael 3D (en adelante, matriz o matriz de membrana de sótano) para su posterior análisis con inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente.