凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学

マウスまたはヒトの暗号を小腸または結腸から長期間にわたって3次元(3D)オルガノイドとして培養する能力は、これらの培養物が生体内の腸上皮の特徴を定義するので、大きなブレークスルーを提供した^1,2,3.原発性暗号に由来するオルガノイドは、自己更新および自己組織化が可能であり、起源の組織と同様の細胞機能を示す。実際、オルガノイドは、生体内のクリプトの構造組織だけでなく、多くの分子特徴を要約し、正常な生物学や疾患状態を研究するのに有用なツールを提供します。例示するために、オルガノイド研究は、組織再生1、2、3、4、5だけでなく、機能を増強することができる薬物に関与する新しい分子経路を明らかにした病理学的設定6、7で。

腸幹細胞の研究は、腸内層が最も再生性の高い哺乳類組織の一つであるため、特に興味深いものであり、細菌、毒素、およびその他の病原体から生物を保護するために3〜5日ごとに更新する腸の内気。腸幹細胞(ISC)は、この顕著な再生能力を担い、成人幹細胞機能1、2を研究するためのユニークなパラダイムを提供します。マウスの系統トレース実験は、単離されたLgr5陽性幹細胞を培養して、3Dオルガノイドまたは「ミニ腸」をインビトロで生成し、インビボに近い形でそれらが密接にミラーリングできることを実証した。オルガノイド培養はまた、前駆体、ISC、およびパネス細胞からなる腸暗号細胞単離物から導き出され、後者は生体内の上皮ニッチ細胞を構成する。実際、原発性腸暗号細胞からのオルガノイド培養は、広く利用可能な試薬を使用してほとんどの実験室で実装しやすい比較的日常的な技術に進化しています。このモデルはまた、質量分析、免疫組織化学、または免疫蛍光染色2、4、8によるRNAシーケンシング(RNA-Seq)およびタンパク質による遺伝子発現の定量分析にも適している。さらに、機能遺伝学は、機能ゲイン(活性化変異遺伝子の遺伝子過剰発現または発現)または機能喪失(遺伝子サイレンシングまたは機能喪失変異体の発現)^{アプローチ2}を用いて研究することができる。

重要なことに、ポリブレンを用いた標準的なプラスミドDNAまたはウイルス伝達プロトコルの低効率および高毒性は、この分野における大きなハードルのままである。CRISPR/Cas9技術は正確なゲノム編集を可能にしますが、このアプローチでは、シーケンス検証9に続いて時間のかかる選択が必要です。ここでは、磁気ナノ粒子への結合と磁場の応用によりウイルス粒子の送達を最適化する一次腸内オルガノイドのウイルス伝達プロトコルを提示する。以前のプロトコル4、5、10、11、12、13および効率を高めるための推奨事項に対する主要な変更が提供される。また、免疫組織化学または免疫蛍光染色を用いたさらなる分析のために、3Dマトリゲル(以下、地下膜マトリックスまたはマトリックスと呼ばれる)で培養された無傷のオルガノイドから凍結切片を生成するアプローチについても説明する。