Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

La capacità di coltura delle cellule di certera umana o di topo come organoidi tridimensionali (3D) dall’intestino tenue o dal colon per periodi di tempo prolungati ha fornito un importante passo avanti perché queste culture mostrano caratteristiche distintive dell’epitelio intestinale in vivo ^{1 : il} nome del ^{, 2 Il} nome del sistema ^{, 3}. Gli organidi derivati dalle cripte primarie sono in grado di auto-rinnovamento e di auto-organizzazione, che esibiscono funzioni cellulari simili ai loro tessuti di origine. Infatti, gli organoidi riassumono non solo l’organizzazione strutturale delle cripte in vivo, ma anche molte caratteristiche molecolari, fornendo così strumenti utili per studiare i normali stati di biologia e malattia. Per illustrare, studi organoidi hanno rivelato nuovi percorsi molecolari coinvolti nella rigenerazione dei tessuti^1,2,3,4,5 così come farmaci che potrebbero migliorare la funzione nelle impostazioni patologiche^6,7.

Lo studio delle cellule staminali intestinali è di particolare interesse perché il rivestimento intestinale è tra i tessuti mammiferi più altamente rigenerativi, rinnovandosi ogni 3-5 giorni per proteggere l’organismo da batteri, tossine e altri agenti patogeni all’interno del lumen intestinali. Le cellule staminali intestinali (ISC) sono responsabili di questa notevole capacità rigenerativa e forniscono così un paradigma unico per studiare la funzione delle cellule staminali adulte^1,2. Gli esperimenti di tracciamento del lignaggio nei topi hanno dimostrato che le cellule staminali isolate lgr5-positive possono essere coltivate per generare organoidi 3D o “mini-guts” in vitro dove rispecchiano da vicino le loro controparti in vivo. Le colture organoidi possono anche essere derivate da isolati di cellule crittogiformi intestinali costituiti da progenitori, ISC e cellule di Paneth, quest’ultima delle quali costituiscono le cellule di nicchia epiteliali in vivo. Infatti, la coltura organoide dalle cellule primarie della cripta intestinale si è evoluta in una tecnica relativamente di routine che è facile da implementare nella maggior parte dei laboratori utilizzando reagenti ampiamente disponibili. Questo modello è anche suscettibile di analisi quantitativa dell’espressione genica mediante RNA-sequencing (RNA-Seq) e proteine per spettrometria di massa, immunohistochimica o colorazione immunofluorescente^2,4,8. Inoltre, la genetica funzionale può essere studiata utilizzando il guadagno di funzione (sopraespressione genica o espressione di un gene mutante attivatore) o la perdita di funzione (silenziamento genico o espressione di un mutante di perdita di funzione) si avvicina².

È importante sottolineare che la bassa efficienza e l’elevata tossicità del DNA plasmide standard o dei protocolli di trasduzione virale con polibrene rimangono un ostacolo importante nel campo. Sebbene la tecnologia CRISPR/Cas9 consenta un editing preciso del genoma, questo approccio richiede una selezione che richiede molto tempo seguita dalla convalida della sequenza⁹. Qui presentiamo un protocollo di trasduzione virale per organoidi intestinali primari che ottimizza la consegna di particelle virali mediante coniugazione a nanoparticelle magnetiche e l’applicazione di un campo magnetico. Vengono fornite modifiche chiave ai protocolli precedenti^{4,5,10,11,12,13} e sono disponibili raccomandazioni per migliorare l’efficienza. Descriviamo anche un approccio per generare sezioni congelate da organoidi intatti coltivati in matrigel 3D (d’ora in poi indicato come matrice della membrana seminterrato o matrice) per ulteriori analisi con immunohistochimica o colorazione immunofluorescente.