الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة
Summary
نحن نصف تعليمات خطوة بخطوة إلى: 1) هندسة بكفاءة الأعضاء المعوية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية للاندوشن لينتي أو الرجعية، و، 2) توليد أقسام المجمدة من الأعضاء المهندسة. ويوفر هذا النهج أداة قوية لتغيير التعبير الجيني بكفاءة في الأعضاء للتحقيق في الآثار النهائية.
Abstract
توفر الثقافات العضوية المعوية فرصة فريدة للتحقيق في الخلايا الجذعية المعوية وبيولوجيا السرداب في المختبر، على الرغم من أن النهج الفعالة للتعامل مع التعبير الجيني في الأعضاء قد حققت تقدما محدودا في هذا المجال. في حين أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم الدقيق للخلايا لتوليد الأعضاء، فإن هذه الاستراتيجية تتطلب اختيارًا وفرزًا واسعًا من خلال تحليل التسلسل، وهو أمر يستغرق وقتاً طويلاً ومكلفًا على حد سواء. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لنقل الفيروسية كفاءة من الأعضاء المعوية. هذا النهج سريع وعالي الكفاءة، وبالتالي تقليل الوقت والنفقات المتأصلة في تكنولوجيا CRISPR/Cas9. كما نقدم بروتوكولا لتوليد أقسام مجمدة من الثقافات العضوية سليمة لمزيد من التحليل مع تلطيخ المناعية الكيميائية أو الفلورسنت المناعية، والتي يمكن استخدامها لتأكيد التعبير الجيني أو إسكات. بعد أن يتم تحقيق انتقال ناجح من النواقل الفيروسية للتعبير الجيني أو إسكات، يمكن تقييم الخلايا الجذعية المعوية ووظيفة سرداب بسرعة. على الرغم من أن معظم الدراسات العضوية تستخدم في الاختبارات المختبرية، يمكن أيضا أن يتم تسليم الأعضاء إلى الفئران للتحليلات الوظيفية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن نُهجنا مفيدة للتنبؤ بالاستجابات العلاجية للأدوية لأن العلاجات المتاحة حاليا تعمل عموما عن طريق تعديل التعبير الجيني أو وظيفة البروتين بدلا من تغيير الجينوم.
Introduction
القدرة على ثقافة الماوس أو خلايا سرداب الإنسان كما ثلاثي الأبعاد (3D) الأعضاء من الأمعاء الدقيقة أو القولون على مدى فترات زمنية طويلة قدمت اختراقا كبيرا لأن هذه الثقافات عرض ملامح تعريف ظهارة الأمعاء في الجسم الحي 1 , 2 , 3. العضوية المستمدة من سرداب الأولية قادرة على التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي، وتظهر وظائف الخلوية مماثلة لأنسجة المنشأ الخاصة بهم. في الواقع، فإن الأعضاء تُخزّن ليس فقط التنظيم الهيكلي للأقبية في الجسم الحي، ولكن أيضاً العديد من السمات الجزيئية، وبالتالي توفير أدوات مفيدة لدراسة البيولوجيا الطبيعية وحالات المرض. لتوضيح ذلك، كشفت الدراسات العضوية مسارات جزيئية جديدة تشارك في تجديد الأنسجة1،2،3،4،5، فضلا عن الأدوية التي يمكن أن تعزز وظيفة في الإعدادات المرضية6،7.
دراسة الخلايا الجذعية المعوية ذات أهمية خاصة لأن بطانة الأمعاء هي من بين أنسجة الثدييات الأكثر تجديدا للغاية، وتجديد نفسها كل 3-5 أيام لحماية الكائن الحي من البكتيريا والسموم، وغيرها من مسببات الأمراض داخل اللومن المعوية. الخلايا الجذعية المعوية (ISCs) هي المسؤولة عن هذه القدرة التجديدية الرائعة وبالتالي توفير نموذج فريد لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية الكبار1،2. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب في الفئران أن الخلايا الجذعية الإيجابية Lgr5 المعزولة يمكن أن يتم زرعها لتوليد أجهزة عضوية ثلاثية الدائية أو “أحشاء صغيرة” في المختبر حيث تعكس عن كثب نظيراتها في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستمد الثقافات العضوية من عزل خلايا سرداب الأمعاء تتألف من الذرية، ISCs، وخلايا بانيث، وهذا الأخير التي تشكل الخلايا المتخصصة الظهارية في الجسم الحي. في الواقع، تطورت الثقافة العضوية من خلايا سرداب الأمعاء الأولية إلى تقنية روتينية نسبيا التي من السهل تنفيذها في معظم المختبرات باستخدام الكواشف المتاحة على نطاق واسع. هذا النموذج هو أيضا قابلة للتحليل الكمي للتعبير الجيني عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) والبروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي، والكيمياء المناعية، أو تلطيخ الفلورسنت المناعي2،4،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة علم الوراثة الوظيفية باستخدام كسب الوظيفة (التعبير المفرط للجين أو التعبير عن جين متحول المنشط) أو فقدان الوظيفة (إسكات الجينات أو التعبير عن متحولة فقدان الوظيفة) النهج2.
والأهم من ذلك، أن انخفاض الكفاءة والسمية العالية للحمض النووي البلازمي القياسي أو بروتوكولات الانكل الفيروسي مع البوليبرين لا تزال تشكل عقبة رئيسية في هذا المجال. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم بدقة، فإن هذا النهج يتطلب اختيارًا يستغرق وقتاً طويلاً متبوعًا بالتحقق من صحة التسلسل9. هنا، نقدم بروتوكول تحويل الفيروسية للأعضاء المعوية الأولية التي يحسن تسليم الجسيمات الفيروسية عن طريق الاقتران إلى الجسيمات النانوية المغناطيسية وتطبيق حقل مغناطيسي. وترد التعديلات الرئيسية على البروتوكولات السابقة4و5و10و11و12 و13 وتوصيات لتعزيز الكفاءة. كما نقوم بوصف نهج لتوليد أقسام مجمدة من الأعضاء السليمة المستزرعة في matrigel 3D (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم مصفوفة غشاء الطابق السفلي أو مصفوفة) لمزيد من التحليل مع الكيمياء المناعية أو تلطيخ الفلورسنت المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الثقافة الأولية للظهارة المعوية الكبار كما organoids يوفر أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في وظيفة الخلايا الجذعية، التوازن الظهاري المعوي، وعلم الأمراض1،2،3، 4. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 يمكن استخدامها ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للصحة (R01DK102943، R03CA182679، R03CA191621)، وصندوق ميريلاند لبحوث الخلايا الجذعية (2015-MSCRFE-1759، 2017-MSCRFD-3934)، وجمعية الرئة الأمريكية، وشبكة أليغيني الصحية – جونز صندوق هوبكنز للبحوث ومركز هوبكنز للبحوث الأساسية للبحوث الهضمية.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
