Kombinasyon tedavisi Trichostatin A ve C vitamini fareler somatik hücre nükleer Transfer tarafından klonlama daha etkili olmasını sağlar.

Tüm hayvan yordamları Kindai Üniversitesi yönergeleri için bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için standartlarla uyumlu. 1. Kültür medya hazırlanması Değiştirilmiş KSOM (mKSOM) orta oluşan 95 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 0.35 mM KH2PO4, 0.2 mM MgSO4 · embriyo kültürü için hazırlamak 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0.2 mM D (+)-glikoz, 0.2 mM sodyum Pyruvate, 1.0 mM L-glutamin, 1.0 g/L Polyvinylpyrrolidone (PVP), 25.07 mM NaHCO3, 10 mM sodyum DL-laktat, 0,05 g/L penisilin ve 0,05 g/L streptomisin steril su. CZB (HCZB) Hepes tampon orta 81.5 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.7 mM CaCl2 · oluşan embriyo manipülasyon için hazırlamak 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0.11 mM EDTA · 2Na, 36.1 mM sodyum DL-laktat, 5,55 mM D (+)-glikoz, 0.025 g/mL penisilin, 0.035 g/L streptomisin, 0,014 mM fenol Red, 1.0 g/L polivinil alkol, 5.0 mM NaHCO3ve 20,0 mM Hepes sodyum tuzu steril su. Oosit harekete geçirmek için harekete geçirmek orta hazırlamak: 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µg/mL cytochalasin B (CB) ve 5 mM SrCl2takıma mKSOM orta. 2. hazırlık, deiyonize sığır Serum Albumin (dBSA) Sığır serum albumin (BSA) 1,2 g 10 mL steril su oda sıcaklığında (% 12’si son bir konsantrasyon) geçiyoruz. BSA, oda sıcaklığında hafif karıştırarak ile steril su % 12’si hazırlanan yaklaşık 0.12 g karışık iyon değiştirme reçine boncuk yukarıda ekleyin. Boncuk mavi-yeşil renk değiştirdiğinizde bir pipet kullanarak süpernatant çözüm altın için yeniden elde etmek. Boncuk ile taze yerine olanlar (şekil 1).Not: Boncuk yerine normal olarak yalnızca bir kez gerçekleştirilir. Muhtemelen tam Deiyonizasyon için birkaç değişiklik gerektirir. Renk boncuk üzerinden değişmeden kalırsa sadece bir rehber olarak, mavi-yeşil altın, bu iyon değişimi tamamlandıktan gösterir. Çözüm boncuk renk değişikliği yok olduğunu onayladıktan sonra yeniden elde etmek.Not: kurtarılan çözüm bulutlu hale gelirse, bu filtre (175 x g, 5 min) tıkanma santrifüj kapasitesi. Kurtarılan ek 250 µL % 10.5 NaHCO3ile belgili tanımlık eriyik.Not: Bu işlem dBSA çözüm pH durumu etkisiz hale getirmek için tasarlanmıştır. Ancak, NaHCO3 gereksiz olabilir. 0.45 µm filtre kullanarak süpernatant sterilize ve dBSA hisse senedi çözüm olarak-20 ° C’de depolayın. 3. yumurta toplama Not: Tüm fareler ışık kontrol edilir ve klimalı odalarda muhafaza. Süper yumurtlamak-her kadın B6D2F1 fare (yaşında 8-10 hafta) hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) 7.5 IU mayi enjeksiyonu ile ve insan Korionik gonadotropin (hCG) 48 saat sonra PMSG enjeksiyon 7.5 IU. Ötenazi servikal çıkığı 14-16 h gerçekleştirmek sonra hCG enjeksiyonu. Üreme sistemi standart diseksiyon teknikleri13kullanarak erişmek için karın deşmek. Kısaca, Cilt pinch ve küçük bir yan kesi orta hat makasla olun. Cilt sıkıca üstünde ve altında belgili tanımlık kesme tutun ve deri baş ve kuyruk doğru çekin. Makas kullanarak karın zarını kesmek, gut bobinleri yoldan itmek ve rahim, oviducts ve yumurtalıklar iki korna varlığını doğrulamak. Oviducts küçük düz makas ve cımbız ile imha etmek, bir filtre yüzeyi kapalı kan silmek için kağıt üzerine yerleştirin. Oviducts madeni yağ içinde ayarlayın. O zaman, diseksiyon iğne kullanarak ovidukt ampulla kadar kesilmiş ve 200 µL damla %0,1 hyaluronidase ile HCZB orta ovidukt ampulla girdiği kümülüs oosit kompleksleri taşıyın. 5 dakika ısınma plaka üzerinde kuluçkaya.Dikkat: %0,1 hyaluronidase ile HCZB ortamda 10 dk daha uzun bir pozlama için yumurta zararlı olur. Kümülüs hücreleri dan cumulus oosit kompleksleri transfer ikinci segregasyonun metafaz (MII) sahne yumurta ile bazı kalan kümülüs hücreleri mKSOM orta içeren %0,3 dBSA için bir stereomicroscope altında yayımlanan onaylayın. Sonra MII sahne yumurtalar yukarı ve aşağı pipetting tarafından dört kez yıkayın (bir pipet kullanarak < 100 µm iç çap) içinde kalan kümülüs hücreleri ayırma için mKSOM orta içeren %0,3 dBSA.Not: Dekolmanı kümülüs hücreleri küçük bir pipet kullanımını kolaylaştırır. Mll sahne yumurta mKSOM orta içeren % 0,3 dBSA 37 ° c altında %5 içinde kuluçkaya CO2 kuluçka enükleasyon kadar.Not: Biraz yumurta daha büyük bir çap ile küçük bir pipet önerilir. 4. nükleer Transfer için donör hücreleri hazırlanması 3.3-3.5, adımları sonra denuded yumurta cumulus oosit kompleksleri izole edilmiştir. Küçük bir miktar (yaklaşık 2 µL) %0.1 hyaluronidase ile HCZB ortamda kümülüs oosit kompleksleri gelen HCZB orta % 6 dBSA ile bir stereomicroscope altında bir pipet kullanarak dağınık kalan kümülüs hücreleri transferi. Kümülüs hücreleri SCNT için ihtiyaç kadar 37 ° C’de ısınma plaka üzerinde % 6 dBSA ile HCZB ortam yerleştirin.Not: Zaman fibroblast hücreleri (örn., fare fetal fibroblast hücreleri) çoğu donör hücreleri olarak kullanılan, doku kültürü çanak hücrelerden bağlantısını kesin ve onları bir Pelet santrifüj kapasitesi. Pelet hücrelerinin % 6 dBSA içeren HCZB orta resuspend. 5. enükleasyon yumurta 10 mL HCZB Orta-0.9 g PVP ekleyerek % 9 PVP orta hazırlamak, buzdolabında gecede (4 ° C) tutmak ve sonra 0,45 µm filtre kullanarak sterilize. CB hisse senedi Çözümleri (konsantrasyonu 1 mg/mL) Dimetil sülfoksit (DMSO) için 5 mL 5 mg CB ekleyerek hazırlayın. HCZB orta (5 µg/mL nihai bir konsantrasyon) CB hisse senedi Çözümle sulandırmak ve enükleasyon çözüm kullanın. Teneffüs edilmesi ve sterilize pipet exhaling Mll sahne yumurta 5 µg/mL CB (enükleasyon çözüm) içeren HCZB orta 20 µL içinde yıkayın (iç çapı: 200 µm için 150 µm). Yıkama işlemi beş kez tekrarlayın. Yaklaşık 10 dk enükleasyon çözümde ısınma plaka üzerinde enükleasyon işlemine başlamadan önce bekleyin. Enükleasyon odası şekil 2Agösterildiği gibi hazırlayın. Teneffüs edilmesi ve pipet kullanarak exhaling enükleasyon odasına Mll yumurta transferi (iç çapı: 200 µm için 150 µm); enükleasyon çözüm 4 µL yerleştirin ve odası mineral yağ ile kaplayın.Not: 60 mm Petri kabına bir kapak bir oda yerine kullanılabilir. İğler ve MII sahne yumurta oda sıcaklığında (400 X) mikroskopla, kromozomlar tanımlar. Mll sahne oosit belirgin ilk kutup gövdeli iğ ve kromozom konumlandırma 3 ya da saat 9’dan bir holding pipet ve micropipette kullanarak (şekil 2B) konumunu biridir gelecek şekilde yönlendirin.Not: kullanılan mikroskop toplam 400 X büyütme lensler var. Objektif lens N.A 5 X / 0,12 ve 40 X / 0.55 da. Piezo darbe pipet sürüş hızlı zona pelusida sondaj izin verir. Buna ek olarak, bir lazer sistemi (örneğin, XYClone) de zona pelusida piezo sürüş sistemi yerine delme için kullanılabilir. 3-6 için piezo darbe yoğunluk ayarlamak ve sürüş piezo darbe ile Embriyolardan pipet (7-8 µm iç çapı düz uçlu tıp) kullanarak zona pelusida matkap. Zona pelusida içinde bir delik açtıktan sonra tamamen İğler ve kromozomlar sitoplazma (şekil 2C) en az bir miktarı ile enucleate.Not: Bu işlem sırasında yumurtalar sıkıca çanak alt eklemek veya BSA14olmadan orta nedeniyle pipet eğilimindedir. 10 dk içinde enükleasyon işleminin tamamlanması gereken ve enucleated yumurta kuluçka makinesi için iade edilmesi gerekir. Uygun bir enükleasyon manipüle edilebilir yumurtalar 10 ile 20 arasında sayısıdır. Yumurtalar daha büyük gruplar için enükleasyon yordamı tekrarlanır. Görünür ışık (şekil 2C, orta) altında sitoplazma içinde kromozomlar yokluğu onaylayın, sonra enucleated yumurta iyice CB eksik % 0,3 dBSA içeren mKSOM ortamda yıkayın. 37 ° C’de % 5 ‘un altında kuluçka çanak tanıtmak CO2 hücre füzyon kadar.Not: enükleasyon sonra İğler ve kromozomlar ooplasm kaldırıldı sitoplazma içerir. 6. füzyon Enucleated bir yumurta ve bir donör hücre HVJ-E hazırlanması Buz gibi HVJ-E süspansiyon çözüm 260 µL liyofilize HVJ-E Ekle ( Malzemeleri masaseti, görmek) ve yukarı ve aşağı tamamen askıya kadar pipet.Not: Bir şişede liyofilize HVJ-E uygun miktarda hazırlanır ve 260 µL HVJ-E süspansiyon çözüm Seti’nde bulunur. 5 µL aliquots HVJ-E çözüm hazırlamak ve hücre füzyon kadar-80 ° C’de depolayın.Dikkat: sıcaklığa duyarlı olduğundan dikkatli bir şekilde HVJ-E buz üzerinde tedavi. Deney, uygun şekilde otoklav HVJ-E malzemeleri ve kapsayıcılar tamamen virüs bileşenleri devre dışı bırakma tamamlandıktan sonra. Hücre Füzyon Hücre Füzyon arabelleği kullanımdan hemen önce 20 µL ile HVJ-E çözüm µL 5 oranında seyreltin. Seyreltilmiş HVJ-E çözüm kadar kullanmak Buza koyun.Not: Hücre füzyon arabellek HVJ-E Seti’nde bulunur. Hücre Füzyon odası şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi hazırlayın. Enucleated yumurta HCZB Orta olarak hücre füzyon odası pipet kullanarak transfer (iç çapı: 200 µm için 150 µm); yer 4 µL her çözüm (% 6 -BSA için donör hücreleri, HVJ-E çözüm, HCZB orta, % 9 içeren HCZB orta HCZB orta PVP) ve odası yaklaşık 1 mL mineral yağ ile kaplayın.Not: Uygun düzenleme sırasında bir hücre füzyon yordamı için odasına transfer enucleated yumurta 5’ten 30’a sayısıdır. Yumurtalar daha büyük gruplar için hücre füzyon yordamı tekrarlanır. Odası yerine, 60 mm Petri kabına kapak, varsa kullanılabilir. Enucleated yumurta HCZB orta 400 X magnificationat oda sıcaklığında bir mikroskop altında yerleştirin. Embriyolardan pipet (6-7 µm iç çapı düz uçlu tıp) kullanarak donör hücreleri Aspire edin ve HVJ-E süspansiyon çözümde hücreleri sınırdışı. O zaman kümülüs hücreleri birer birer eşit birbirinden, seri hücre füzyon etkinleştirme ayrılması için HVJ-E süspansiyon solüsyonu ile Aspire edin. Enucleated yumurta bir holding pipet kullanarak HCZB ortamda tutmak. Piezo darbe (yoğunluğu 3-6, hızına göre 2-3) ile Embriyolardan pipet ile zona pelusida matkap. Zona pelusida delik açtıktan sonra oosit membran gitmeden kümülüs oosit membran, HVJ-E süspansiyon çözüm bir birim 5 kere kümülüs hücre hacmi ile birlikte sıkıca hücreye yerleştirin.Not: 6-7 µm iç çapı düz uçlu ipuçları Embriyolardan Pipetler, kümülüs hücreleri için hazır olun. Pipetler % 9 PVP orta yumuşak hücre yayın korumak için düzenli olarak kullanarak yıkanmalıdır. Adımları 6.2.3 – 6.2.5 10 dk içinde bitirilmesi gereken veya hücre füzyon verimliliği düşük olacaktır. Membran füzyon faaliyet HVJ-e ısıyla, deterjan veya % 70 etanol ile tedavi tarafından inaktive. Bunu deneyden sonra HVJ-E çözüm uygun şekilde bertaraf gerekir. Hücre Füzyon manipülasyon sonra derhal yumurta mKSOM orta içeren %0,3 dBSA için transfer ve 37 ° C’de % 5 ‘un altında bir kuluçka gitme CO2 1 h için. 7. etkinleştirme yeniden yumurta ve tedavi ile Trichostatin A ve C vitamini TSA hazırlanması 5 mM TSA çözüm 3 µL aliquots dağıtmak ve çözüm-20 ° C’de depolayın 5 mM TSA hisse senedi çözüm 2.5 µL DMSO (12,5 µM konsantrasyonu) için 1 mL ekleyin. 8 µL 12.5 µM TSA hisse senedi çözüm mKSOM orta ve harekete geçirmek orta 2 ml seyreltik (son bir konsantrasyon 50 nM). VC hazırlanması VC 1 mg 1 mL steril endotoksin ücretsiz su içine ekleyin ve -20 ° C’de depolayın VC hisse senedi çözüm mKSOM orta (son 10 µg/mL konsantrasyonu) ekleyin. Yeniden oluşturulan yumurta aktivasyonu Bir saat sonra hücre füzyon, mikroskop (400 X) kullanarak erken kromozom yoğunlaşma (PCC) yeniden yumurta (şekil 3B) içinde kontrol. Yeniden oluşturulan yumurta harekete geçirmek ortamına aktarmak (bkz. Adım 1.3) TSA içeren ve 37 ° c altında %5 6 h için kuluçkaya CO2 hava (şekil 3 c). Pro-çekirdek içinde SCNT embriyo oluşumu gözlemlemek sonra 2 saat daha mKSOM orta içeren % 0.3 dBSA (şekil 2C) tedavisinde TSA uygulayın. 7 saat için şekil 3Dgösterildiği gibi kuluçkaya ve VC ile desteklenmiş mKSOM orta TSA tedavi edilen embriyolar transfer. 7 saat VC tedavi sonra mKSOM orta içeren %0,3 dBSA için VC-tedavi embriyo transfer ve 37 ° c altında %5 4 gün kuluçkaya havada CO2 .Not: klonlanmış farelerin üretmek için morfolojik normal 2-hücre sahne embriyo içine sözde hamile kadın fareler (MCH(ICR)) vajinal bir fiş (gün 0,5 pseudopregnancy)15bulunduğunda günü. oviducts transfer 19,5 gün sonra sezaryen sonra implantasyon siteleri ve yeni doğanların sayısı kaydedilir.