Комбинационный лечения трихостатин А и витамин С улучшает эффективность клонирования мышей путем переноса ядер соматических клеток

Все животные процедуры соответствовал руководящим принципам Kindai университета для ухода и использования лабораторных животных. 1. Подготовка культуры средств массовой информации Подготовить измененный КСОМ (mKSOM) средний для культуры эмбрион, состоящий из 95 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 0,35 мм х2PO4, 0,2 мм MgSO4 · 7H2O, 1.71 мм CaCl2 · 2H2O, 0,2 мм D (+)-глюкоза, 0,2 мм пируват натрия, 1,0 мм L-глютамином, 1,0 г/Л поливинилпирролидона (ПВП), 25.07 мм NaHCO3, 10 мм DL-Лактат натрия, 0,05 г/Л пенициллина и стрептомицина в стерильной воде 0,05 г/Л. Подготовка среднего Hepes амортизированное CZB (HCZB) для манипуляции эмбрион, состоящий из 81,5 мм NaCl, 4,8 мм KCl, 1.7 CaCl2 · 2H2O, 1,18 мм MgSO4 · 7H2O, 1,18 мм х2PO4, 0,11 мм ЭДТА · 2На, 36,1 мм DL-Лактат натрия, 5.55 мм D (+)-глюкоза, 0,025 г/мл пенициллин, 0,035 г/Л стрептомицина, 0,014 мм фенола красного, поливиниловый спирт 1,0 г/Л, 5.0 мм NaHCO3и 20,0 мм Hepes натриевой соли в стерильной воде. Приготовить средство активации для активации ооцитов: mKSOM средний дополнена 50 Нм TSA, 2 мм EGTA, 5 мкг/мл cytochalasin B (CB) и 5 мм SrCl2. 2. подготовка в деионизированной бычьим сывороточным альбумином (Брюа) 1.2 g бычьим сывороточным альбумином (БСА) растворяют в 10 мл стерильной воды при комнатной температуре (конечная концентрация 12%). Добавьте около 0,12 г смешанных ионообменные смолы бисера выше подготовил 12% BSA в стерильной воде при комнатной температуре с мягким перемешиванием. Когда бисер цвета от сине зеленого золота, восстановить супернатанта решения с помощью пипетки. Затем замените свежим бисер (рис. 1).Примечание: Замена бисера обычно выполняется только один раз. Возможно, он требует несколько замен для завершения деионизации. Только в качестве ориентира, если цвет бисера остается неизменным от сине зеленый с золотом, он указывает, что ионного обмена является полным. Восстановление решение после подтверждения, что нет никакого изменения цвета в бисер.Примечание: Если восстановленные решение становится мутным, центрифуги для предотвращения засорения фильтра (175 x g, 5 мин). Дополнить восстановленные решение с 250 мкл 10,5% NaHCO3.Примечание: Данный процесс предназначен для нейтрализации рН условие решения Брюа. Однако NaHCO3 может быть необязательным. Стерилизовать супернатанта, с помощью фильтра 0.45 мкм и хранить при температуре-20 ° C как Брюа Стоковый раствор. 3. яйцеклетка коллекция Примечание: Все мышей были сохранены в свете контролируемую и кондиционированные номера. Супер овуляция каждая женщина B6D2F1 мышь (в возрасте 8-10 недель) внутрибрюшинной инъекцией 7,5 МЕ гонадотропина сыворотки беременных Маре (ГСЖК) и 7,5 ед хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) 48 ч после инъекции ГСЖК. Выполнять эвтаназии, вывих шейного 14-16 ч после инъекции ХГЧ. Надрезать живота для доступа к репродуктивного тракта, используя стандартные рассечение методы13. Вкратце ущипнуть кожу и сделать небольшой боковой разрез на средней линии с ножницами. Придерживайте кожу прочно выше и ниже разреза и потяните кожу головы и хвоста. Вырезать ножницами брюшины, нажмите катушки кишечнике в сторону и подтвердить наличие двух рогов матки, яйцеводов и яичников. Истребить яйцеводов с небольшой прямые ножницы и щипчики, место на листе бумаги фильтр, чтобы стереть кровь с поверхности. Установите яйцеводов в минеральном масле. Затем разрезать ампула маточных труб, с помощью иглы рассечение и переместить комплексов кучевые ооцитов, приходя от ампула маточных труб в 200 мкл капли HCZB среды с 0.1% гиалуронидазы. Инкубируйте 5 мин на потепления тарелку.Предупреждение: Экспозиции более чем 10 мин в HCZB среде с 0.1% гиалуронидаза бы пагубные последствия для ооцитов. Убедитесь, что отель cumulus клетки освобождаются от кучевые ооцитов комплексы под стереомикроскопом, передача второй meiotic метафазы (MII) стадии яйцеклеток с некоторых оставшихся кучевые клетки mKSOM средних содержащие 0,3% Брюа. Затем, мыть ооциты стадии MII четыре раза, закупорить вверх и вниз (с помощью пипетки из < внутренний диаметр 100 мкм) в mKSOM средних содержащие 0,3% Брюа для отсоединения оставшиеся ячейки кучевые.Примечание: Использование небольших пипетки облегчает отряд кучевые клеток. Инкубировать Mll стадии яйцеклеток в mKSOM средних содержащие 0,3% Брюа при 37 ° C под 5% CO2 инкубатора до Энуклеация.Примечание: Рекомендуется небольшой пипетку с диаметром, что немного больше, чем в яйцеклетку. 4. Подготовка клеток донора для передачи ядерной После шаги 3.3-3.5 оголенные ооциты изолированы от комплексов кучевые ооцитов. Передача оставшихся кучевые клетки рассеяны от кучевые ооцитов комплексов в HCZB среде с 0.1% гиалуронидаза средний HCZB с 6% Брюа с помощью пипетки под стереомикроскопом небольшое количество (примерно 2 мкл). Место кучевые клетки в HCZB среде с 6% Брюа на потепление пластине при 37 ° C до тех пор, пока необходимые для SCNT.Примечание: Когда клетки фибробластов (например., мышиных плода фибробластов клетки), используется в качестве доноров клеток, отсоединить клетки культуры ткани блюдо и центрифуги их в гранулах. Ресуспензируйте Пелле клеток в HCZB среде, содержащей Брюа 6%. 5. Энуклеация ооцитов Подготовка 9% PVP среднего, добавив 0,9 г PVP 10 мл HCZB средний, держать в холодильнике на ночь (4 ° C) и затем стерилизовать его с помощью фильтра 0.45 мкм. Подготовьте CB акций решения (концентрации 1 мг/мл), добавив 5 мг CB до 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Разбавить CB Стоковый раствор с HCZB среднего (конечная концентрация 5 мкг/мл) и использовать как Энуклеация решения. Мыть Mll стадии яйцеклеток в 20 мкл HCZB среды, содержащие 5 мкг/мл CB (Энуклеация раствор), вдыхая и выдыхая через стерилизованные пипетки (внутренний диаметр: 150 мкм до 200 мкм). Повторите процедуру Стиральная пять раз. Подождите приблизительно 10 минут на пластину потепления в растворе Энуклеация перед запуском процесса Энуклеация. Подготовьте Энуклеация камеру, как показано на рисунке 2А. Переноса ооцитов Mll Энуклеация камеру путем вдыхания и exhaling с помощью пипетки (внутренний диаметр: 150 мкм до 200 мкм); место 4 мкл раствора Энуклеация и охватывают в камеру с минеральным маслом.Примечание: Вместо камере, может использоваться кавер-60 мм Петри. Идентифицировать шпинделей и хромосомы яйцеклеток стадии MII под микроскопом (400 X) при комнатной температуре. Ориент Mll стадии ооцитов с выраженным первого полярного тельца, так что позиционирование шпинделя и хромосомы в 3 или 9 часов позиции (рис. 2B), с помощью пипетки Холдинг и микропипеткой.Примечание: Микроскоп используется имеет линзы 400 X увеличением в общей сложности. Кроме того объектив Н.А-5 X / 0.12 и 40 X / 0,55. Пьезо вождение импульса из пипетки позволяет быстрое сверление zona pellucida. Кроме того лазерная система (например, XYClone) также может использоваться для бурения вителлинового вместо системы вождения piezo. Установите интенсивность импульсов пьезо-3-6 и сверлить в zona pellucida, с помощью пипетки микроманипуляции (7-8 мкм внутренний диаметр закончилась с плоским отзыв) с пьезо пульс вождения. После открытия отверстие в zona pellucida, полностью enucleate шпинделей и хромосом с минимальным количеством цитоплазмы (рис. 2 c).Примечание: В ходе этого процесса, ооциты склонны плотно прикрепить к нижней блюдо или Пипетка благодаря среде без BSA14. В течение 10 мин Энуклеация процесс должен быть завершен, и enucleated яйцеклеток должны быть возвращены в инкубаторе. Соответствующее количество яйцеклеток, которыми можно управлять в одном Энуклеация находится между 10 и 20. Для более крупных партий яйцеклеток Энуклеация процедура повторяется. Подтвердить отсутствие хромосом в цитоплазме под видимого света (рис. 2 c, средний), а затем тщательно вымыть enucleated яйцеклеток в mKSOM среде, содержащей 0,3% Брюа хватает CB. Представить блюдо инкубатора при 37 ° C под 5% CO2 до слияния клеток.Примечание: После Энуклеация, цитоплазме, удалены от ooplasm содержит шпинделей и хромосом. 6. слияние клеток донора и Enucleated ооцитов Подготовка HVJ-E 260 мкл раствора ледяной HVJ-E подвеска лиофилизированные HVJ-е (из комплекта, см. Таблицу материалы) и Пипетка вверх и вниз до тех пор, пока полностью приостановлено.Примечание: В бутылку готовится соответствующее количество лиофилизированные HVJ-E, и 260 мкл HVJ-E подвеска раствор входит в комплект. Подготовить 5 аликвоты мкл раствора HVJ-E и затем хранить при температуре-80 ° C до слияния клеток.Предупреждение: Внимательно относиться к HVJ-E на льду, так как это чувствительных к температуре. После завершения эксперимента, надлежащим образом автоклав HVJ-E материалы и контейнеры для полностью инактивировать вирус компонентов. Слияние ячеек Разбавьте 5 мкл раствора HVJ-E с 20 мкл буфера слияние ячеек непосредственно перед использованием. Место разбавленный раствор HVJ-E на льду до использования.Примечание: Буфер фьюжн клетки входит в комплект HVJ-Е. Подготовка камеры слияние клеток, как показано на рисунке 3A. Передавать HCZB среднего enucleated яйцеклеток на камеру синтеза клеток с помощью пипетки (внутренний диаметр: 150 мкм до 200 мкм); место 4 мкл каждого решения (HCZB носитель содержит 6% -BSA для клеток донора, раствор HVJ-E, HCZB средний, 9% PVP в HCZB среде) и охватывают в камеру с примерно 1 мл минерального масла.Примечание: Соответствующее количество энуклеированные ооцитов, которые передаются в палату для манипуляций в ходе одной процедуры слияния клеток составляет от 5 до 30. Для больших пакетов яйцеклеток повторяется процедура по сплавливания клеток. Вместо камеры Петри 60-мм крышка может использоваться, если таковые имеются. Место enucleated яйцеклеток в HCZB среде под микроскопом при комнатной температуре 400 X magnificationat. Аспирационная клеток донора, с помощью пипетки микроманипуляции (6-7 мкм внутренний диаметр закончилась с плоским отзыв) и высылать клетки в HVJ-E подвеска решение. Затем, аспирационная кучевые клетки по одному HVJ-E подвеска раствором, чтобы быть одинаково отделены друг от друга, позволяя серийный клеток фьюжн. Держите enucleated яйцеклеток в HCZB среде с помощью пипетки Холдинг. Дрель вителлинового с микроманипуляции пипетку с пьезо импульса (интенсивность скорость 3-6, 2-3). После открытия в отверстие в zona pellucida, место кучевые клетки плотно мембраны яйцеклетки, наряду с HVJ-E подвеска решение с объемом 5 раз превышает объем ячейки, кучевые, без прохождения через мембраны яйцеклетки.Примечание: 6-7 мкм внутренний диаметр плоским, закончившийся советы микроманипуляции пипеток подготовиться кучевые клеток. Пипетки должны мыть регулярно используя 9% PVP средство для поддержания гладкой клетки релиз. Шаги 6.2.3 – 6.2.5 должна быть завершена в течение 10 мин, или эффективность синтеза клеток будет ниже. Мембрана фьюжн активности HVJ-e обезврежена автоклавирования, лечение с моющими средствами, или 70% этиловом спирте. После эксперимента HVJ-E решения надлежащим образом утилизировать. После манипуляций синтеза клеток, оперативно передать mKSOM средних содержащие 0,3% Брюа яйцеклеток и перейти к инкубатора при 37 ° C под 5% CO2 на 1 ч. 7. Активация реконструированный ооцитов и лечение с трихостатин А и витамин С Подготовка ВСТ Отказаться от 5 мм ВСТ решения в 3 мкл аликвоты и сохранить решение при-20 ° C. 2.5 мкл 5 мм ВСТ Стоковый раствор, по 1 мл ДМСО (концентрация 12,5 мкм). Развести 8 мкл раствора 12,5 мкм TSA запасов в 2 мл активации среднего и среднего mKSOM (конечная концентрация 50 Нм). Подготовка VC Добавьте VC 1 мг в 1 мл стерильной воды, эндотоксинов свободной и хранить при температуре от-20 ° C. Добавьте решение штока VC mKSOM среднего (конечной концентрации 10 мкг/мл). Активация реконструированный яйцеклеток Один час после слияния клеток, проверьте преждевременной хромосома конденсации (PCC) в реконструированных ооцитов (рис. 3B) с помощью микроскопа (400 X). Передать реконструированный ооциты средство активации (см. шаг 1.3) содержащий TSA и инкубировать в течение 6 ч при 37 ° C под 5% CO2 в воздухе (рис. 3 c). Наблюдать за формирование pro ядер в SCNT эмбрионов, а затем применить 2 часов лечения TSA в mKSOM средних Брюа содержащие 0,3% (рис. 2 c). Передача TSA-лечить эмбрионы mKSOM средний дополнена VC и проинкубируйте 7 h, как показано на рисунке 3D. После 7 h VC лечения, передать mKSOM средних содержащие 0,3% Брюа VC-лечить эмбрионы и инкубировать в течение 4 дней при 37 ° C под 5% CO2 в воздухе.Примечание: Для получения клонированной мышей, передача морфологически нормальных этап 2-клеток эмбрионов в яйцеводов псевдо-беременных самок мышей (MCH(ICR)) в день, когда Вагинальные вилка найден (день 0,5 pseudopregnancy)15. После 19,5 дней количество сайтов имплантации и новорожденных записываются после кесарева сечения.