Combinacional tratamento de tricostatina A e a vitamina C melhora a eficiência da clonagem de ratos por transferência Nuclear de células somáticas

Todos os procedimentos de animais em conformidade com as diretrizes da Universidade Kindai para o cuidado e o uso de animais de laboratório. 1. preparação de meios de cultura Preparar o meio KSOM (mKSOM) modificado para cultura de embriões, consistindo de 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO4, 0,2 mM de MgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D (+)-glicose, piruvato de sódio, de 0.2 mM 1.0 mM L-glutamina, 1,0 g/L de polivinilpirrolidona (PVP), mM 25,07 NaHCO3, 10 mM DL-lactato de sódio 0,05 g/L de penicilina e estreptomicina em água estéril de 0,05 g/L. Prepare o suporte do tampão Hepes CZB (HCZB) para a manipulação do embrião, consistindo de 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2NA, 36,1 mM DL-lactato de sódio, 5,55 mM D (+)-glicose, 0,025 g/mL penicilina, estreptomicina de 0,035 g/L, 0,014 mM vermelho de fenol, álcool polivinílico 1,0 g/L, 5,0 mM NaHCO3e 20,0 mM Hepes sal de sódio em água estéril. Prepare o suporte de ativação para a ativação do ovócito: mKSOM suplementado com 50 nM TSA, 2mm EGTA, 5 µ g/mL citocalasina B (CB) e 5 mM SrCl2. 2. preparação de água deionizada albumina de soro bovino (dBSA) Dissolva 1,2 g de albumina de soro bovino (BSA) em 10 mL de água estéril à temperatura ambiente (uma concentração final de 12%). Adicione cerca de 0,12 g de grânulos de resina de troca iônica misturado ao acima preparadas 12% de BSA em água estéril à temperatura ambiente com agitação suave. Quando os grânulos mudam cor de azul esverdeado a ouro, recuperar a solução sobrenadante com uma pipeta. Em seguida, substituir os grânulos com o fresco ones (Figura 1).Nota: A substituição dos grânulos normalmente é executada apenas uma vez. Possivelmente requer algumas substituições de desionização completa. Apenas como um guia, se a cor dos grânulos permanece inalterada desde azul esverdeado a ouro, indica essa troca iônica está completa. Recupere a solução depois de confirmar que não há alteração de cor em grânulos.Nota: Se a solução recuperada torna-se nublado, centrifugar para evitar o entupimento do filtro (175 x g, 5 min). Complementar o recuperado a solução com 250 µ l de 10,5% NaHCO3.Nota: Este processo destina-se para a solução de dBSA neutralizar a condição de pH. No entanto, NaHCO3 pode ser dispensável. Esterilizar o sobrenadante usando um filtro de 0,45 µm e armazenar a-20 ° C como solução estoque dBSA. 3. oócito coleção Nota: Todos os ratos foram mantidos em quartos com ar condicionado e luz controlada. Superovular cada rato de B6D2F1 feminino (idade 8-10 semanas) por injeção intraperitoneal de 7,5 UI de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG) e 7,5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) 48 h após a injeção de PMSG. Realizar a eutanásia por deslocamento cervical 14-16 h após a injeção de hCG. Faça uma incisão no abdômen para acessar o trato reprodutivo, usando técnicas de dissecação padrão13. Brevemente, beliscar a pele e fazer uma pequena incisão lateral na linha com uma tesoura. Mantenha a pele firmemente acima e abaixo da incisão e puxe a pele em direção a cabeça e a cauda. Cortar o peritônio usando a tesoura, empurre as bobinas do intestino fora do caminho e confirmar a presença dos dois chifres de ovários, os ovidutos e o útero. Estirpar ovidutos com pequena tesoura reta e pinças, colocar em uma folha de papel de filtro para limpar o sangue fora da superfície. Defina os ovidutos em óleo mineral. Em seguida, cortar na ampola de oviduto usando agulhas de dissecação e mover os complexos cumulus-oócito provenientes da ampola do oviduto em 200 gotas µ l de meio HCZB com hialuronidase 0,1%. Incube durante 5 min em uma placa de aquecimento.Atenção: Uma exposição de mais de 10 min no meio de HCZB com 0,1% hialuronidase seria prejudicial para os oócitos. Confirme que as células do cumulus são liberadas de complexos cumulus-oócito sob um estereomicroscópio, segundo transferência metáfase meiótica (MII) palco oócitos, com algumas células cumulus restantes para mKSOM médio contendo 0,3% dBSA. Em seguida, lave os oócitos de estágio MII quatro vezes pipetando para cima e para baixo (usando uma pipeta de < 100 µm de diâmetro interno) em mKSOM médio contendo 0,3% dBSA para desanexar as restantes células do cumulus.Nota: O uso de uma pipeta pequena facilita o desprendimento das células cumulus. Incubar os oócitos de palco Mll em mKSOM médio contendo dBSA 0,3% a 37 ° C abaixo dos 5% CO2 incubadora até enucleação.Nota: Recomenda-se uma pequena pipeta com um diâmetro que é ligeiramente maior do que o oócito. 4. preparação de células de doadores por transferência Nuclear Depois passos 3.3-3.5, desnudos oócitos são isolados os complexos cumulus-oócito. Transferi uma pequena quantidade (cerca de 2 µ l) das restantes células cumulus dispersadas de complexos cumulus-oócito em meio HCZB com hialuronidase 0,1% para o meio HCZB com 6% dBSA usando uma pipeta sob um estereomicroscópio. Coloque as células do cumulus em meio HCZB com 6% dBSA na placa de aquecimento, a 37 ° C, até que seja necessário para TNCS.Nota: Quando células de fibroblastos (EG., células de fibroblasto fetal murino) são usados como as células do doador, separar as células de um prato de cultura de tecidos e centrifugue-los em uma pelota. Ressuspender o precipitado de células em meio de HCZB, contendo 6% dBSA. 5. Enucleação de ovócitos Preparar médio de 9% PVP adicionando 0,9 g PVP para 10 mL de meio de HCZB, manter na geladeira durante a noite (4 ° C) e em seguida esterilizá-lo usando um filtro de 0,45 µm. Prepare soluções estoque de CB (concentração de 1 mg/mL) com a adição de 5 mg de CB a 5 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a solução-mãe CB com média HCZB (uma concentração final de 5 µ g/mL) e usar como solução de enucleação. Lave os oócitos de palco Mll em 20 µ l de meio de HCZB contendo 5 µ g/mL CB (solução de Enucleação) por inalar e exalar através da pipeta esterilizada (diâmetro interno: 150 µm a 200 µm). Repita o procedimento de lavagem cinco vezes. Espere cerca de 10 min sobre a placa de aquecimento em solução de Enucleação antes de iniciar o processo de enucleação. Prepare a câmara de Enucleação, conforme mostrado na Figura 2A. Transferir os oócitos Mll para a câmara de Enucleação por inalar e exalar usando a pipeta (diâmetro interno: 150 µm a 200 µm); Coloque 4 µ l da solução de Enucleação e cubra a câmara com óleo mineral.Nota: Em vez de uma câmara, uma tampa de uma caixa de Petri de 60 mm pode ser usada. Identifica os eixos e cromossomos do oócito de estágio MII sob um microscópio (400x), à temperatura ambiente. Oriente o oócito de palco Mll com o pronuncia-se primeiro corpo polar, de modo que o posicionamento do eixo e do cromossoma é o 3 ou 09:00 posição (Figura 2B), usando uma pipeta de exploração e micropipeta.Nota: O microscópio usado tem lentes de ampliação de X 400 no total. Além disso, a lente objetiva N.D. é 5 X / 0.12 e 40 X / 0.55. A condução de pulso piezo da pipeta permite rápida perfuração da zona pelúcida. Além disso, um sistema de laser (por exemplo, XYClone) também é útil para a perfuração da zona pelúcida no lugar do sistema de condução de piezo. Defina a intensidade de pulso piezo para 3-6 e perfurar a zona pelúcida usando uma pipeta de micromanipulação (7-8 µm diâmetro interno extremidade plana ponta) com o pulso de piezo dirigindo. Depois de abrir um buraco na zona pelúcida, completamente enucleate os fusos e cromossomos com uma quantidade mínima de citoplasma (Figura 2).Nota: Durante este processo, oócitos costumam firmemente anexar para o fundo do prato ou Pipetar devido o meio sem BSA14. Dentro de 10 min, deve ser concluído o processo de Enucleação e oócitos sem núcleo precisam ser retornado para a incubadora. O número apropriado de oócitos que podem ser manipulados em uma enucleação é entre 10 e 20. Para lotes maiores de oócitos, o procedimento de Enucleação é repetido. Confirmar a ausência de cromossomos no citoplasma sob luz visível (Figura 2, médio) e, em seguida, lave os oócitos sem núcleo em meio de mKSOM contendo 0,3% dBSA falta CB. Introduzir o prato para a incubadora a 37 ° C abaixo de 5% de CO2 até fusão celular.Nota: Após Enucleação, o citoplasma retirado ooplasma contém os fusos e cromossomos. 6. a fusão de uma célula doadora e um ovócito sem núcleo Preparação de HVJ-E Adicionar 260 µ l da solução de suspensão HVJ-E gelada para HVJ-E liofilizado (do kit, consulte a Tabela de materiais) e pipetar acima e para baixo até totalmente suspenso.Nota: A quantidade adequada de liofilizado HVJ-E é preparada em uma garrafa, e solução de suspensão 260 µ l HVJ-E está incluído no kit. Prepare 5 alíquotas µ l da solução HVJ-E e em seguida, armazenar a-80 ° C até a fusão celular.Atenção: Trate cuidadosamente o HVJ-E no gelo, uma vez que é sensível à temperatura. Após a conclusão do experimento, apropriadamente autoclave HVJ-E materiais e recipientes para inativar completamente componentes do vírus. Fusão celular Dilua a 5 µ l de solução de HVJ-E com 20 µ l de buffer de fusão celular, imediatamente antes do uso. Coloque a solução diluída de HVJ-E no gelo até o uso.Nota: A reserva de fusão celular está incluída no kit HVJ-E. Prepare a câmara de fusão celular, como mostrado na Figura 3A. Transferir os oócitos sem núcleo para meio de HCZB na câmara de fusão celular, usando a pipeta (diâmetro interno: 150 µm a 200 µm); lugar 4 µ l de cada solução (meio de HCZB, contendo 6% -BSA para as células do doador, solução HVJ-E, HCZB médio, 9% PVP no meio de HCZB) e cobrir a câmara, com cerca de 1 mL de óleo mineral.Nota: O número apropriado de oócitos sem núcleo que são transferidas para a câmara para manipulação durante um processo de fusão de células é de 5 a 30. Para lotes maiores de oócitos, o processo de fusão celular é repetido. Em vez de câmara, uma prato de Petri 60mm tampa pode ser usada, se disponível. Coloque os oócitos sem núcleo médio e HCZB sob um microscópio à temperatura de 400 X magnificationat. Aspirar as células do doador com a pipeta de micromanipulação (6-7 µm diâmetro interno extremidade plana dica) e expulsar células em solução de suspensão HVJ-E. Em seguida, Aspire células cumulus um por um com a solução de suspensão HVJ-E igualmente ser separados uns dos outros, permitindo a fusão celular serial. Manter os oócitos sem núcleo médio e HCZB usando uma pipeta de exploração. Perfure a zona pelúcida, com a pipeta de micromanipulação com o pulso de piezo (intensidade de 3-6, velocidade de 2-3). Depois de abrir o orifício na zona pelúcida, coloque uma célula cumulus firmemente para a membrana do oócito, juntamente com a solução de suspensão HVJ-E com um volume de 5 vezes o volume de uma célula de cumulus, sem atravessar a membrana do oócito.Nota: Prepare dicas extremidade plana de 6-7 µm diâmetro interno de pipetas de micromanipulação para células do cumulus. Pipetas devem ser lavadas regularmente usando meio de PVP de 9% para a manutenção de liberação suave da célula. Etapas 6.2.3 – 6.2.5 devem ser terminadas dentro de 10 min, ou a eficiência de fusão celular será menor. Atividade de fusão da membrana do HVJ-E é inativada por autoclave, tratamento com detergente, ou etanol a 70%. Após a experiência, a solução HVJ-E deve ser devidamente eliminada. Após a manipulação de fusão celular, prontamente transferência de oócitos para mKSOM médio contendo 0,3% dBSA e mover para uma incubadora a 37 ° C abaixo de 5% de CO2 por 1h. 7. a ativação dos oócitos reconstruídos e tratamento com tricostatina A e vitamina C Preparação de TSA Dispense o TSA de 5 mM a solução em 3 alíquotas µ l e armazenar a solução a-20 ° C. Adicione 2,5 µ l de solução-mãe de TSA 5 mM a 1 mL de DMSO (uma concentração de 12,5 µM). Diluir 8 µ l de 12,5 µM TSA solução em 2 mL do meio de ativação e mKSOM médio (uma concentração final de 50 nM). Preparação de CV Adicionar 1 mg de VC em 1 mL de água estéril livre de endotoxinas e armazenar a-20 ° C. Adicione a solução de estoque VC para mKSOM médio (uma concentração final de 10 µ g/mL). Ativação de oócitos reconstruídos Uma hora após a fusão celular, verifique a condensação cromossomo prematuro (PCC) em oócitos reconstruídos (Figura 3B) usando um microscópio (400x). Transferir os oócitos reconstruídos para o meio de ativação (consulte a etapa 1.3) contendo TSA e incubar durante 6 h a 37 ° C abaixo de 5% de CO2 no ar (Figura 3). Observar a formação de pro-núcleos nos embriões TNCS e, em seguida, aplicar-se 2 horas a mais de tratamento TSA em mKSOM médio contendo 0,3% dBSA (Figura 2). Transferir os embriões tratados com TSA para mKSOM suplementado com VC e incubar durante 7 h, conforme mostrado na Figura 3D. Depois de 7 h de tratamento VC, transferir os embriões tratados com VC para mKSOM médio contendo 0,3% dBSA e incubar durante 4 dias a 37 ° C abaixo de 5% de CO2 no ar.Nota: Para produzir ratos clonados, transferir embriões morfologicamente normal 2-célula de estágio para os ovidutos de camundongos fêmeas grávidos pseudo (MCH(ICR)) no dia quando um plugue vaginal é encontrado (dia 0,5 de pseudopregnancy)15. Depois de dias de 19,5, o número de locais de implantação e recém-nascidos é registado após cesariana.