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Developmental Biology

Kombinatorische Behandlung von Trichostatin A und Vitamin C verbessert die Effizienz des Klonens Mäuse durch Kerntransfer somatischer Zellen

Published: April 26, 2018
doi:
10.3791/57036
, , , ,
1Division of Biological Science, Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology,Kindai University, 2Faculty of Biology-Oriented Science and Technology,Kindai University, 3Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute and Department of Zoology,University of Cambridge, 4Laboratory of Reproductive Biology, Graduate School of Agriculture,Kyoto University, 5Institute of Advanced Technology,Kindai University

Summary

Wir beschreiben eine dramatisch verbesserte Methode für Maus Klonen mit entionisiertem Rinderserumalbumin Trichostatin A und Vitamin C. Wir zeigen eine vereinfachte, reproduzierbare Protokoll, die effiziente Entwicklung von geklonten Embryonen unterstützt. Diese Methode könnte daher ein standardisiertes Verfahren zum Klonen von Maus geworden.

Abstract

Somatische Zellkerntransfer (SCNT) bietet eine einzigartige Gelegenheit, eine geklonte Tier aus einer Zelle Spender direkt zu produzieren, und es erfordert den Einsatz von geschickten Techniken. Darüber hinaus haben die Effizienz des Klonens seit der erfolgreichen Produktion von geklonten Tieren, vor allem Mäuse gering geblieben. Es wurden viele Versuche zur Verbesserung der Klonierungseffizienz und Trichostatin A (TSA), ein Histon Deacetylase Inhibitor, weithin verwendet wurde, um die Effizienz des Klonens. Hier berichten wir über eine deutlich verbesserte Klonmethode bei Mäusen. Diese somatischen Kerntransfers Methode bezieht Verbrauch Hemagglutinating Virus Japan Envelope (HVJ-E), die einfache Handhabung ermöglicht. Darüber hinaus ist die Behandlung mit zwei kleinen Molekülen, TSA und Vitamin C (VC), mit entionisiertem Rinderserumalbumin (dBSA), hochwirksam für die Embryonalentwicklung. Dieser Ansatz erfordert weder zusätzliche Injektion noch genetische Manipulation und stellt somit eine einfache Methode für den praktischen Einsatz geeignetste. Diese Methode könnte ein technisch Machbaren Ansatz für Forscher, die gentechnisch veränderte Tiere aus kultivierten Zellen produzieren werden. Darüber hinaus kann es eine nützliche Methode für die Rettung der bedrohten Tiere über Klonen sein.

Introduction

Die SCNT-Technologie ermöglicht die Produktion von geklonten Tieren mit nur eine Somatische Zelle oder ein Kern auf eine entkernte Eizelle übertragen werden. Eines der Ziele der SCNT-Technik ist die Ableitung der Kerntransfer embryonale Stammzellen (NT-WSR) Zeilen aus geklonten Embryonen. Im Jahr 1998 Wakayama Et Al., berichtet produziert erfolgreich geklonte Maus Cumulina für die erste Zeit1benannt. Seitdem das Klonen von Mäusen umfassend untersucht worden, und viele wichtige Erkenntnisse zur nuklearen Reprogrammierung von somatischen Kernen gewonnen wurden. Auf der anderen Seite ist diese Technik begleitet von zahlreichen Mikromanipulation Schritte, die ziemlich schwierig, Meister, erfordert intensive Training von mehr als 3 Monate2.

Produktion von geklonten Mäusen mit SCNT entwickelte sich aus der ursprünglichen Honolulu Methode1, Elektroschweißen Methode3, zu der Zelle fusionsmethode von Hemagglutinating Virus von Japan (HVJ)4. Aber tendenziell die direkte Einspritzung von einem Zellkern durch die Cytomembrane Eizelle überleben nachteilig beeinflussen. Das Elektroschweißen ist arm an Effizienz, da jeder Zellmembran unterschiedlichen Härte, so dass es schwierig zu bestimmen, eine optimale Kondition hat. Die Handhabung der HVJ ist mühsam, weil es spezifische Ausrüstung für die Sicherheit von Forschern und Labortieren erfordert. Um den Spender Zelle und Eizelle Zytoplasma verschmelzen, neuerdings HVJ-E verwendet5. HVJ-E hat nur die Möglichkeit, Membranen ohne proliferative oder infektiösen Viren zu verschmelzen. Genomische RNAs HVJ sind vollständig inaktiviert im HVJ-E. Die Verwendung von HVJ-E unterstützt damit die einfache Handhabung der Zellfusion während SCNT.

Mehrere Berichte haben gezeigt, dass die Behandlung von SCNT Embryonen mit TSA, ein Histon Deacetylase Inhibitor, deutlich die Effizienz der Produktion der live Welpen von weniger als 1 % bis 6,5 %6,7 verbessert. TSA Behandlung beschleunigt Umprogrammierung durch Ändern von Histon-Marken in SCNT Embryonen8. Vor kurzem, Injektion von bestimmten mRNAs, Histon Lysin Demethylase Unterfamilie 4 (KDM4), die Histone H3 Lysin 9 (H3K9) entfernen Trimethylation in SCNT Embryonen, vor allem im umprogrammieren-resistente Regionen wurde gezeigt, dass Entwicklung erhöhen geklonte Maus-Embryonen-9. Unterdessen hat VC, dient auch als ein Histon-Modifikator, Trimethylation H3K910verringert. Zudem steigert VC Embryonalentwicklung in porcinen SCNT10. Es wurde berichtet, dass die Injektion von dBSA SCNT Embryonen zur Verbesserung der Embryonalentwicklung11führt.

Zuvor fanden wir, dass die Kombination von kleinen Molekülen, nämlich TSA und VC, zusammen mit dBSA, Entwicklung von SCNT Embryonen12dramatisch verbessert. Hier zeigen wir die bisher gemeldete SCNT Methode für Mäuse, die höchst effizient und einfach Klonen Verfahren12darstellt. Wir beschreiben auch die Handhabung der HVJ-E. Dies könnte dazu beitragen, dass viele Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungs- und reproduktive Biologie zur Erhaltung genetischer Ressourcen oder gentechnisch veränderte Tiere durch diese SCNT-Methode zu produzieren.

Protocol

Alle tierische Verfahren entsprach den Richtlinien der Kindai Universität für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Vorbereitung von Nährmedien Bereiten Sie das modifizierte KSOM (mKSOM)-Medium für Embryonenkultur, bestehend aus 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO40,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D (+)-Glukose, 0,2 mM Natrium Pyruvat, 1,0 mM L-Glutamin, 1,0 g/L Polyvinylpyrrolidon (PVP), 25,07 mM Nahco33, 10 mM Natrium DL-Laktat, 0,05 g/L Penicillin und 0,05 g/L Streptomycin in sterilem Wasser. Vorbereiten der Embryo Manipulation, bestehend aus 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · Mediums Hepes gepufferten CZB (HCZB) 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2NA, 36,1 mM Natrium DL-Laktat, 5,55 mM D (+)-Glukose, 0,025 g/mL Penicillin 0,035 g/L Streptomycin, 0,014 mM Phenol rot, 1,0 g/L Polyvinylalkohol, 5,0 mM Nahco33und 20,0 mM Hepes Natriumsalz in sterilem Wasser. Eizelle Aktivierung Aktivierung Medium vorbereiten: mKSOM Medium mit 50 nM TSA, 2 mM EGTA 5 µg/mL Cytochalasin B (CB) und 5 mM SrCl2ergänzt. 2. Vorbereitung der deionisiertes Rinderserumalbumin (dBSA) Lösen Sie 1,2 g von Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mL sterilem Wasser bei Raumtemperatur (eine Endkonzentration von 12 %). Fügen Sie ca. 0,12 g gemischte Ionenaustausch-Harz Perlen zu den oben genannten 12 % der BSA in sterilem Wasser bei Raumtemperatur unter schonenden rühren vorbereitet. Wenn die Perlen Farbwechsel von blau-grün, Gold, die überstehende Lösung mit einer Pipette zu erholen. Ersetzen Sie die Perlen mit dem frischen, (Abbildung 1).Hinweis: Die Ersetzung der Perlen wird normalerweise nur einmal durchgeführt. Es erfordert möglicherweise ein paar Ersatz zu vollständigen Entmineralisierung. Nur als Orientierungshilfe, wenn die Farbe der Perlen von unverändert blau-grün, Gold, es zeigt, dass Ionenaustausch ist abgeschlossen. Die Lösung nach der Bestätigung, dass gibt es keinen Farbwechsel in den Perlen zu erholen.Hinweis: Wenn die wiederhergestellten Lösung trüb wird, Zentrifugieren Sie um zu verhindern, dass Verstopfung des Filters (175 X g, 5 min). Der wiederhergestellten ergänzen die Lösung mit 250 µL von 10,5 % Nahco33.Hinweis: Dieser Prozess richtet sich an die dBSA Lösung pH Zustand zu neutralisieren. Nahco33 kann jedoch entbehrlich. Den Überstand mit einem 0,45-µm-Filter zu sterilisieren und bei-20 ° C als dBSA Stammlösung speichern. 3. die Eizellenentnahme Hinweis: Alle Mäuse waren gepflegt in lichtgesteuerten und klimatisierte Zimmer. Super-Eisprung jeden weiblichen B6D2F1 Maus (im Alter von 8 bis 10 Wochen) durch intraperitoneale Injektion von 7,5 IE trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG) und 7,5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG) 48 h nach der PMSG-Injektion. Euthanasie durch zervikale Dislokation 14-16 Uhr durchzuführen nach der hCG-Injektion. Einschneiden des Bauches um die Fortpflanzungsorgane mit standard Dissektion Techniken13zuzugreifen. Kurz gesagt, drücken Sie die Haut und machen Sie einen kleinen seitlichen Einschnitt an der Mittellinie mit einer Schere. Halten Sie die Haut fest oberhalb und unterhalb der Schnitt und ziehen Sie die Haut in Richtung Kopf und Schweif. Schneiden Sie das Bauchfell mit einer Schere, schieben Sie die Windungen des Darms aus dem Weg und bestätigen Sie das Vorhandensein von zwei Hörner der Gebärmutter, der Eileiter und die Eierstöcke. Auszurotten Sie röhrenförmig mit kleinen geraden Scheren und Pinzetten, legen Sie auf ein Blatt Filterpapier, das Blut von der Oberfläche wischen. Legen Sie die Eileiter in Mineralöl. Dann der Ampulle des Eileiters mit Dissektion Nadeln zerschnitten Sie, und verschieben Sie die Cumulus-Eizelle komplexe aus der Ampulle des Eileiters in 200 µL Tropfen des HCZB Mediums mit 0,1 % Hyaluronidase. 5 min auf einer Warmhalteplatte inkubieren.Achtung: Eine Ausstellung von mehr als 10 min in HCZB Medium mit 0,1 % Hyaluronidase wäre schädlich für die Eizellen. Bestätigen Sie, dass die kumuluszellen von Cumulus-Eizelle komplexe unter einem Stereomikroskop Transfer zweiten meiotischen Metaphase (MII) Bühne Eizellen mit einigen verbliebenen kumuluszellen, mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA freigegeben werden. Dann waschen die MII Bühne Eizellen viermal durch pipettieren rauf und runter (mit einer Pipette der < 100 µm Innendurchmesser) in mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA zum Lösen der verbleibenden kumuluszellen.Hinweis: Die Verwendung von einer kleinen Pipette erleichtert die Ablösung von der kumuluszellen. Inkubieren Mll Bühne Eizellen in mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 Inkubator bis Enukleation.Hinweis: Eine kleine Pipette mit einem Durchmesser, der etwas größer ist als das der Eizelle wird empfohlen. 4. Vorbereitung der Spenderzellen Kerntransfer Nach Schritten 3.3-3.5 sind entblößte Eizellen von der Cumulus-Eizelle komplexe isoliert. Eine kleine Menge (ca. 2 µL) der verbleibenden Cumulus Zellen verteilt von Cumulus-Eizelle-komplexe in HCZB Medium mit 0,1 % Hyaluronidase, HCZB Medium mit 6 % dBSA mithilfe einer Pipette unter einem Stereomikroskop zu übertragen. Legen Sie die kumuluszellen in HCZB Medium mit 6 % dBSA auf die Warmhalteplatte bei 37 ° C bis für SCNT benötigt.Hinweis: Wenn fibroblastenzellen (zB., murinen embryonalen fibroblastenzellen) sind als Spenderzellen, lösen die Zellen aus einer Gewebekultur Schüssel und Zentrifugieren sie in einem Pellet. Aufzuwirbeln Sie das Pellet von Zellen in HCZB 6 % dBSA-haltigem Medium. 5. Enukleation der Eizellen 9 % PvP-Medium durch Zugabe von 0,9 g PVP auf 10 mL HCZB Medium vorbereiten, halten im Kühlschrank über Nacht (4 ° C) und Sterilisieren Sie es mit einem 0,45 µm-Filter. Bereiten Sie CB-Stammlösungen (Konzentration von 1 mg/mL vor) durch Zugabe von 5 mg von CB bis 5 mL des Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Verdünnen Sie die CB-Stammlösung mit HCZB Medium (eine Endkonzentration von 5 µg/mL) und als Enukleation Lösung verwenden. Waschen Sie die Mll Bühne Eizellen in 20 µL des HCZB Mediums mit 5 µg/mL CB (Enukleation Lösung) von ein- und Ausatmen durch die sterilisierten Pipette (Innendurchmesser: 150 µm bis 200 µm). Wiederholen Sie der Waschvorgang fünf Mal. Warten Sie ca. 10 min auf die Warmhalteplatte in Enukleation Lösung, bevor der Enukleation beginnen. Bereiten Sie die Enukleation Kammer, wie in Abbildung 2Agezeigt. Die Mll Eizellen zur Enukleation Kammer durch ein- und ausatmen mit der Pipette zu übertragen (Innendurchmesser: 150 µm bis 200 µm); Legen Sie 4 µL Enukleation Lösung und bedecken Sie die Kammer mit Mineralöl.Hinweis: Anstelle einer Kammer kann eine Abdeckung von 60 mm Petrischale verwendet werden. Identifizieren Sie die Spindeln und die Chromosomen der MII Bühne Eizelle unter dem Mikroskop (400 X) bei Raumtemperatur. Ausrichten der Mll Bühne Eizelle mit der ausgeprägten erste Polkörper, sodass die Positionierung der Spindel und Chromosom bei der 3 oder 09:00 (Abb. 2 b) Position mit einer haltepipette und Mikropipette ist.Hinweis: Das Mikroskop verwendet hat insgesamt Linsen 400 X Vergrößerung. Außerdem ist das Objektiv N.A 5 X / 0,12 und 40 X / 0,55. Die Piezo Puls der Pipette Führerscheine schnelles Bohren von der Zona Pellucida. Darüber hinaus ist ein Laser-System (z.B.XYClone) auch verwendbar für das Bohren von der Zona Pellucida anstelle von Piezo-Antriebssystem. Die Piezo-Impulsintensität auf 3-6, und Bohren Sie, die Zona Pellucida mit einer Pipette Mikromanipulation (7-8 µm Innendurchmesser Wohnung endete Tip) mit dem Piezo-Puls fahren. Nach dem Öffnen ein Loch in die Zona Pellucida, völlig enucleate Spindeln und Chromosomen mit einer minimalen Menge von Zytoplasma (Abbildung 2).Hinweis: Während dieses Vorgangs tendenziell Eizellen straff befestigen an der Unterseite der Schüssel oder pipette durch das Medium ohne BSA14. Innerhalb von 10 Minuten muss die Enukleation abgeschlossen, und die entkernte Eizellen in den Inkubator zurückgegeben werden müssen. Die entsprechende Anzahl an Eizellen, die in eine Enukleation manipuliert werden kann liegt zwischen 10 und 20. Für größere Chargen von Eizellen ist die Enukleation Prozedur wiederholt. Bestätigen Sie das Fehlen von Chromosomen im Zytoplasma unter sichtbarem Licht (Abbildung 2, Mitte), dann waschen Sie die entkernte Eizellen in mKSOM 0,3 % dBSA fehlt CB-haltigem Medium. Einzuführen, die Schüssel in den Inkubator bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 bis Zellfusion.Hinweis: Nach Enukleation enthält das Zytoplasma vom Spindelapparat entfernt die Spindeln und Chromosomen. 6. Verschmelzung von einem Spender Zelle und eine entkernte Eizelle Vorbereitung der HVJ-E Lyophilisierten HVJ-E 260 µL eiskalte HVJ-E Aussetzung Lösung hinzufügen (aus dem Kit, siehe die Tabelle der Materialien) und rauf und runter bis vollständig suspendiert.Hinweis: Die entsprechende Menge an gefriergetrockneten HVJ-E ist bereit, in eine Flasche und 260 µL HVJ-E Aussetzung Lösung ist im Kit enthalten. 5 µL-Aliquots der HVJ-E Lösung vorzubereiten, und dann bei-80 ° C bis zur Zellfusion lagern.Achtung: Sorgfältig zu behandeln HVJ-E auf Eis, da es temperaturempfindlich ist. Nach Abschluss des Experiments, entsprechend Autoklaven HVJ-E Materialien und Container, Virus-Komponenten vollständig zu inaktivieren. Zellfusion 5 µL HVJ-E Lösung mit 20 µL des Puffers Cell Fusion unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen. Legen Sie die verdünnte Lösung HVJ-E auf dem Eis bis zur Verwendung.Hinweis: Die Zelle-Fusion-Puffer ist im HVJ-E-Kit enthalten. Bereiten Sie der Zelle Fusion Kammer, wie in Abbildung 3Agezeigt. Die entkernte Eizellen zu HCZB Medium zu übertragen, auf der Zelle-Fusion-Kammer mit der Pipette (Innendurchmesser: 150 µm bis 200 µm); Platz 4 µL jeder Lösung (HCZB Medium mit 6 % -BSA für Spenderzellen, HVJ-E Lösung, HCZB Mittel, 9 % PVP in HCZB Medium) und die Kammer mit etwa 1 mL von Mineralöl zu decken.Hinweis: Die entsprechende Anzahl an entkernte Eizellen, die in der Kammer für Manipulationen während einer Zelle Fusion Verfahren übertragen werden ist von 5 bis 30. Für größere Chargen von Eizellen wird die Zelle Fusion Vorgang wiederholt. Anstelle von Kammer kann eine 60 mm Petrischale Decke verwendet werden, falls vorhanden. Legen Sie die entkernte Eizellen in HCZB Medium unter dem Mikroskop bei 400 X magnificationat Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Spenderzellen mit der Mikromanipulation Pipette (6-7 µm Innendurchmesser Wohnung beendet Tipp) und vertreiben Sie Zellen in HVJ-E Aussetzung Lösung zu. Dann Aspirieren Sie kumuluszellen eins nach dem anderen mit der HVJ-E Aussetzung Lösung gleichermaßen voneinander getrennt werden serielle Zellfusion ermöglichen. Halten Sie die entkernte Eizellen in HCZB Medium mit einer haltepipette. Bohren Sie die Zona Pellucida mit der Mikromanipulation Pipette mit dem Piezo-Puls (Intensität der 3-6, Geschwindigkeit von 2-3). Legen Sie nach der Eröffnung des Lochs in der Zona Pellucida eine Cumulus-Zelle eng an die Eizelle Membran, zusammen mit HVJ-E Aussetzung Lösung mit einem Volumen 5-Mal das Volumen einer Cumulus-Zelle, ohne den Umweg über die Membran der Eizelle.Hinweis: Bereiten Sie 6-7 µm Innendurchmesser Wohnung endete Spitzen der Mikromanipulation Pipetten kumuluszellen vor. Pipetten müssen regelmäßig mit 9 % PvP-Medium für die Aufrechterhaltung der glatten Zelle Release gewaschen werden. Schritte 6.2.3 – 6.2.5 müssen innerhalb von 10 min fertig sein, oder die Effizienz der Zellen-Schmelzverfahren wird niedriger sein. Membran-Fusion-Aktivität des HVJ-E ist durch Autoklavieren, Behandlung mit Reinigungsmittel oder 70 % Ethanol inaktiviert. Nach dem Experiment muss die HVJ-E Lösung entsprechend entsorgt werden. Nach Manipulation der Zellfusion, umgehend die Eizellen auf mKSOM mittlerer mit 0,3 % dBSA übertragen und verschieben in einem Inkubator bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 1 h. (7) Aktivierung des rekonstruierten Eizellen und Behandlung mit Trichostatin A und Vitamin C Vorbereitung der TSA Verzichten Sie 5 mM TSA Lösung in 3 µL-Aliquots zu, und speichern Sie die Lösung bei-20 ° C. 1 mL DMSO (eine Konzentration von 12,5 µM) 2,5 µL der Stammlösung 5 mM TSA hinzufügen. Verdünnen Sie 8 µL 12,5 µM-TSA-Stammlösung in 2 mL der Aktivierung und mKSOM Medium (eine Endkonzentration von 50 nM). Vorbereitung der VC VC 1 mg in 1 mL sterilem Endotoxin-freies Wasser hinzufügen und speichern bei-20 ° C. Die VC-Stammlösung zu mKSOM Medium (eine Endkonzentration von 10 µg/mL) hinzufügen. Aktivierung des rekonstruierten Eizellen Eine Stunde nach Zellfusion, überprüfen Sie die vorzeitige Chromosom Kondensation (PCC) in der rekonstruierten Eizellen (Abb. 3 b) unter Verwendung eines Mikroskops (400 X). Die rekonstruierten Eizellen auf die Aktivierung Medium übertragen (siehe Punkt 1.3) mit TSA und inkubieren Sie für 6 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 in Luft (Abbildung 3). Beobachten Sie die Bildung der Pro-Kerne in die SCNT Embryonen zu, dann gelten Sie 2 weitere Stunden der TSA Behandlung in mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA (Abbildung 2). Übertragen Sie die TSA-behandelten Embryonen auf mKSOM Medium ergänzt mit VC und inkubieren Sie 7 h, wie in Abbildung 3Dgezeigt. Nach 7 h der VC-Behandlung, die VC-behandelten Embryonen auf mKSOM mittlerer mit 0,3 % dBSA übertragen und inkubieren Sie für 4 Tage bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 in die Luft.Hinweis: Um geklonte Mäuse zu erzeugen, übertragen Sie morphologisch normalen 2-Zellstadium Embryonen in den Eileiter der Pseudo-schwangeren weiblichen Mäusen (MCH(ICR)) am Tag, wenn ein vaginale Stecker (Tag 0,5 der scheinträchtigkeit)15gefunden wird. Nach 19,5 Tagen erfasst die Anzahl der Implantation Websites und Neugeborenen nach Kaiserschnitt.

Representative Results

Um geklonte Maus-Embryonen zu erzeugen, wurden kumuluszellen und fetalen fibroblastenzellen verwendet. Die Anzahl der rekonstruierten Eizellen und Entwicklung auf dem 2-Zell-Stadium nach der Aktivierung der Eizelle sind in Tabelle 1dargestellt. Eine sehr hohe Rate der man Bildung (89 bis 100 %) und Entwicklung, um das 2-Zell-Stadium (77 bis 89 %) wurden beobachtet, unter allen Bedingungen. Einige der geklonten Embryonen, die die kumuluszellen abgeleitet und entwickelt, um das 2-Zell-Stadium wurden, wurden auf Eileiter der Pseudo-trächtige Weibchen übertragen. Aus drei trächtige Weibchen wurden sechs geklonte Nachkommen aus 72 transferierten Embryonen durch die serielle Behandlung der TSA und VC (Abbildung 4) hergestellt. Etwa 15 % der geklonten Embryonen wurden zum Begriff zu entwickeln, indem Sie folgen dieser SCNT Verfahren12gemeldet. Darüber hinaus erzielt die Übertragung der geklonten Embryonen von 2 Zellen in anderen Institutionen 9 bis 15 % Leben nachkommen, die bessere Entwicklung als der TSA Einzelbehandlung auf geklonten Embryonen darstellt. Darüber hinaus die Behandlung mit TSA und VC deutlich verbessert die Effizienz der in-vitro- embryonalen Entwicklung bis zum Blastozystenstadium (Tabelle 2, P < 0,05, Studenten t-Test). Diese in-vitro- Entwicklungsstörungen Daten zeigen, dass sich der positive Effekt der TSA und VC weder Mausstämme noch Zelltypen beschränkt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode SCNT Entwicklungs Fähigkeit der geklonten Embryonen erlaubt. Abbildung 1: Vorbereitung der dBSA.Schrittweise Anleitungen für die Zubereitung von dBSA Lösung werden dargestellt. Das Ausmaß der Ionen-Austausch kann durch die farbliche Veränderung der Perlen beurteilt werden. Die obere linke Abbildung zeigt, dass 1,2 g BSA wird aufgelöst in 10 mL sterilem Wasser bei Raumtemperatur. Nach BSA aufgelöst wird, werden die Ionenaustausch Harz Perlen (rechts oben) hinzugefügt. Wenn die Mischung der BSA-Lösung mit Ionenaustausch Harz Perlen Farbwechsel von blau-grün, Gold (unten rechts), die Perlen durch frische ersetzen. Die Links unten Abbildung zeigt, dass die Farbe der Perlen blau-grün bleibt und Ionenaustausch ist fertig. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Enukleation Verfahren.(A) eine Darstellung der Enukleation Kammer. Enukleation der Eizellen erfolgt im HCZB Medium mit CB. Für den Piezo-Antrieb dient ein Ort von 9 % PvP-Medium zur Enukleation der Glaspipette Vorbereitung. Flecken sind durch Mineralöl gedeckt. (B) ein Diagramm und ein Schliffbild zeigen die Position der Spindeln und Chromosomen vor Enukleation. Schwarze Pfeilspitzen: die Spindeln und Chromosomen. Roten Pfeilspitzen: der erste Polkörper. (C) A Diagramm und ein Schliffbild zeigen erfolgreiche Enukleation. Schwarze Pfeilspitzen: die Spindeln und Chromosomen. Roter Pfeil: der erste Polkörper. Blaue Pfeilspitze: das Loch in der Zona Pellucida. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Cell Fusion Verfahren und Kultur Zustand SCNT Embryonen.(A) eine Darstellung der Zelle Fusion Kammer. Zellfusion erfolgt in der HCZB 6 % dBSA-haltigem Medium. Ein Ort von 9 % PvP-Medium wird verwendet, um die Glaspipette Zellfusion vorzubereiten. Flecken sind durch Mineralöl gedeckt. (B) ein Diagramm und ein Schliffbild der vorzeitigen Chromosom Kondensation gebildet eine Stunde nach Zellfusion (schwarze Pfeilspitze). (C) A Diagramm und ein Schliffbild der man Struktur gebildet sechs Stunden nach Aktivierung (schwarze Pfeilspitzen). (D) Regelung der TSA, VC und dBSA Behandlung für SCNT Embryonen. Grüner Pfeil stellt die Behandlung mit TSA, gefolgt von Inkubation mit VC (gelber Pfeil) unter mKSOM Medium, die mit 0,3 % dBSA (blauer Pfeil). Pfeilspitzen geben den Zeitpunkt für den Wechsel Medium. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Geklonte Nachkommen von kumuluszellen kurz nach Kaiserschnitt nach 19,5 Tagen der Schwangerschaft abgeleitet.Es gibt Nachgeburten in der oberen Zeile. Die geklonten nachkommen, die hier gezeigt wurden in einem Kerntransfer experimentieren aus drei pflegemütter generiert. Die Größe der Plazenta war 1,5 bis 2 mal größer als die Größe von denen von in-vitro- Befruchtung produziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Gruppe Spender-Zelltyp Maus-Stamm Nein. der Eizellen verwendet Nein. der Eizellen fusioniert Nein. der Eizellen mit vorzeitigen Chromosom Kondensation Nein. der Eizellen zeigt Vorkerne Entstehung (%) Nein. der Vorkerne gebildet Eizellen entwickelt2-Zellen Embryonen (%) TSA, VC Cumulus C57BL/6 × DBA/2 84 82 82 81 (99) 72 (89) unbehandelte Cumulus C57BL/6 × DBA/2 84 82 82 82 (100) 68 (83) TSA, VC fetale Fibroblasten MCH(ICR)×MCH(ICR) 202 171 169 151 (89) 124 (82) unbehandelte fetale Fibroblasten MCH(ICR)×MCH(ICR) 201 171 147 142 (97) 109 (77) Tabelle 1: Effekte der TSA und VC Behandlung auf den in-vitro- Entwicklung von geklonten mäuseembryonen, 2-Zellstadium. Gruppe Spender-Zelltyp Maus-Stamm Nein. 2-Zellen Embryonen verwendet Nein. 2-Zellen Embryonen entwickelt jedes Stadium (%) 4-Zellen Morula Blastozyste TSA, VC Cumulus C57BL/6 × DBA/2 152 152 (100) 149 (98) 135 (89) ein unbehandelte Cumulus C57BL/6 × DBA/2 83 47 (57) 41 (49) 32 (39) b TSA, VC fetale Fibroblasten MCH(ICR)×MCH(ICR) 124 110 (89) 101 (81) 88 (71) c unbehandelte fetale Fibroblasten MCH(ICR)×MCH(ICR) 109 54 (50) 45 (41) 29 (27) d a b c-d Verschiedene hochgestellte Zeichen innerhalb der gleichen Spenderzellen repräsentieren signifikante Unterschiede (P < 0,05) Tabelle 2: Auswirkungen der TSA und VC Behandlung auf den in-vitro- Entwicklung von geklonten Maus-Embryonen bis zum Blastozystenstadium.

Discussion

Zusammenfassend, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die vorgestellte Methode SCNT könnte technische Schwierigkeiten reduzieren, die Effizienz des SCNT ohne gentechnische Veränderungen und mRNA-Supplementierung (Tabelle 1, Tabelle 2) und gewährleisten stabile Produktion von geklonten Embryonen. Diese Methode ermöglicht es uns, mehr SCNT Embryonen als herkömmliche Methoden aufgrund der besseren Überlebensrate und vereinfachte Protokoll zu rekonstruieren. In diesem Protokoll ist ein entscheidender Schritt Zellfusion. Um erfolgreich geklonte Mäuse produzieren, ist es unerlässlich, um sicherzustellen, dass die richtige Menge an HVJ-E im Protokoll beschrieben, während die Zelle Fusionsprozess beibehalten wird und Eizellen in den Inkubator innerhalb von 10 min während der Schritte 6.2.3 – 6.2.5 zurückgegeben werden müssen. Da 20 bis 30 Spenderzellen zusammen mit HVJ-E zu einem Zeitpunkt in die Manipulation Pipette abgesaugt werden können, ist die Anzahl der Eizellen, die durch eine Operation erhalten größer ist als die der vorhandenen Methode. Am Ende produzieren wir etwa 20 bis 30 neu konstruierte Eizellen innerhalb von 10 Minuten. Auch beim Arbeiten mit einem großen Stapel von Eizellen (100 oder mehr), die Zelle-Fusion-Verfahren sollte eine Stunde dauern oder weniger durch Wiederholung der Schritte 6.2.3 – 6.2.5. Die Methode und die hier vorgestellten Techniken dienen als effiziente Protokolle mit vereinfachten technischen Anforderungen.

Derzeit sind die molekularen Mechanismen der Entwicklung von Embryonen SCNT noch unklar. Diese verbesserte SCNT Methode trägt auch zu solchen Neuprogrammierung Mechanismen zu studieren, da diese Methode viele geklonte Embryonen in nur einem einzigen Experiment produzieren kann. Diese Methode verwendet für Zellfusion Körperzellen mit intakten Zellmembranen. Es kann also möglich, diesen Ansatz auf andere Zellen anzuwenden, z. B. Schwanzspitze16 Zellen, Sertoli-17 Zellenund embryonaler Stammzellen (ES)18 Zellen. Bei konventionellen Verfahren mit SCNT für relativ große Zellen, z. B. Heck Tipp Zellen injizieren wird direkt in das Zytoplasma der Eizelle, auch technisch anspruchsvolle live Embryonen zu erhalten. Darüber hinaus sind relativ harte Zellen, wie z. B. Sertoli-Zellen schwer zu brechen, indem für die Injektion pipettieren. Wenn diese verschiedenen Zelltypen berücksichtigt werden, ist die Zelle fusionsmethode HVJ-E Nutzung einfach und effektiv. Obwohl die Werterhaltung und Sicherheit seines HVJ-E überzeugend demonstriert19,20 wurden, könnte es wichtig, die Machbarkeit der Verwendung HVJ-E für die Herstellung von geklonten Tieren für landwirtschaftliche oder biomedizinische Zwecke neu zu überdenken sein.

Darüber hinaus produziert vor kurzem eine Gruppe erfolgreich geklonte Mäuse aus Urin Zellen21abgeleitet. Um vom Aussterben bedrohte Säugetierarten zu retten, wird fortan SCNT Verwendung der Zellen in eine nicht-invasive Weise, wie der Urin Zelle gesammelt ideal sein. In jüngerer Zeit, eine andere Gruppe hat direkt generiert geklonte Mäuse mit Antigen-spezifische CD4-Zellen+ T22. Es wäre interessant zu untersuchen, ob diese Methode auch für Mäuse aus solchen Zellen effizient zu klonen. Darüber hinaus wurde als bessere Alternative zur Inhibierung Aktin-Polymerisation bei Enukleation und parthenogenetische Aktivierung SCNT Eizellen23Latrunculin A berichtet. Zukunftsstudie kann zeigen, ob die Latrunculin A-Behandlung statt Cytochalasin B, Generierung von geklonten Nachkommen weiter verbessert wird. Darüber hinaus hat die TSA-Behandlung erfolgreich in Mäuse und Schweine24Kaninchen25 eingesetzt indem Behandlungszeit, Zeit und Konzentration. Darüber hinaus sind VC nicht nur erhöht die Embryonalentwicklung in porcinen SCNT10, sondern verbessert auch iPS-Zellen-Produktion in den Menschen und Mäusen26. So ist es plausibel zu spekulieren, dass TSA und VC Behandlung auch auf andere Säugetierarten angewendet werden kann, und wir möglicherweise die Behandlungszeit von TSA und VC für jede Art zu optimieren müssen.

Abschließend würde diese Methode geklonte Mäuse mit einem praktischen Maß an Effizienz mit einfachen Verfahren generieren ermöglichen. Daher könnte die Ergebnisse dieser Studie uns die SCNT-Technologie für die Erhaltung der genetischen Ressourcen von seltenen Tieren und für das Verständnis der molekularen Mechanismen der nuklearen Neuprogrammierung und frühen embryonalen Entwicklung nutzen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI-Grant-Nummern JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045, k.m. Sumitomo Foundation Grant für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte (150810, k.m.) unterstützt. Kindai University Research Grant (15-I-2, k.m. und M.A.). M.o. anerkennen das Core-Support von Cancer Research UK (C6946/A24843) und des Wellcome Trust (203144/Z/16/Z) zur Verfügung gestellt.  Wir danken Frau N. Backes-Kamimura und Herr J. Horvat für Korrekturlesen.

Materials

NaCl Sigma-Aldrich, Co., Lcc. 28-2270-5 For medium
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-03542 For medium
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 165-04242 For medium
MgSO4 · 7H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 137-00402 For medium
CaCl2 · 2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 039-00431 For medium
D(+)-Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595 For medium
Sodium Pyruvate Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 199-03062 For medium
L-Glutamine Sigma-Aldrich, Co., Lcc. G3126 For medium
Polyvinylpyrrolidone Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 168-17042 For medium
NaHCO3 Nacalai tesque, Inc. 31213-15 For medium
Sodium DL-Lactate Nacalai tesque, Inc. 31605-72 For medium
Penicillin Meiji Seika Pharma Co., Ltd. 4987222637671 (GTIN-13) For medium
Streptomycin Meiji Seika Pharma Co., Ltd. 4987222665643 (GTIN-13) For medium
Sterile water, endotoxin free Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-15645 For medium
EDTA · 2Na Dojindo Lab. 345-01865 For medium
Phenol red Sigma-Aldrich, Co., Lcc. P0290 For medium
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich, Co., Lcc. H3784 For medium
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich, Co., Lcc. P8136 For medium
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich, Co., Lcc. A3311 For medium
BT AG 501-X8 (D) Resin Bio-Rad Lab., Inc. 143-7425 For preparation of dBSA
Hyaluronidase Sigma-Aldrich, Co., Lcc. H3506 For collection of oocytes and cumulus cells
Cytochalasin B Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 034-17554 For enucleation and oocytes activation
Piezo micro manipulator Prime tech, Co., Ltd. PMM-150FU For micromanipulation
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF Ishihara sangyo kaisha, Ltd. CF001 Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion
SrCl2 · 6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 193-09442 For oocytes activation
EGTA Sigma-Aldrich, Co., Lcc. E8145 For oocytes activation
Dimethyl sulfoxide Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 045-24511 For solvent
Trichostatin A Sigma-Aldrich, Co., Lcc. T1952 For incubating with SCNT embryos
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich, Co., Lcc. A5960 For incubating with SCNT embryos
Mineral oil Sigma-Aldrich, Co., Lcc. M8410 For covering medium
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References

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Azuma, R., Miyamoto, K., Oikawa, M., Yamada, M., Anzai, M. Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer. J. Vis. Exp. (134), e57036, doi:10.3791/57036 (2018).
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