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Developmental Biology

Traitement combinatoire de la trichostatine A et la vitamine C améliore l’efficacité du clonage de souris par transfert nucléaire de cellules somatiques

Published: April 26, 2018
doi:
10.3791/57036
, , , ,
1Division of Biological Science, Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology,Kindai University, 2Faculty of Biology-Oriented Science and Technology,Kindai University, 3Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute and Department of Zoology,University of Cambridge, 4Laboratory of Reproductive Biology, Graduate School of Agriculture,Kyoto University, 5Institute of Advanced Technology,Kindai University

Summary

Nous décrivons une méthode améliorée de façon spectaculaire pour le clonage de souris à l’aide de la trichostatine A, vitamine C et désionisée albumine de sérum bovin. Nous montrons un protocole simplifié et reproductible qui prend en charge le développement efficace des embryons clonés. Par conséquent, cette méthode pourrait devenir une procédure normalisée pour le clonage de souris.

Abstract

Transfert nucléaire de cellules somatiques (TNCS) offre une occasion unique de produire directement un animal cloné dans une cellule de donneur, et nécessite l’utilisation de techniques habiles. En outre, l’efficacité du clonage est demeurées faibles depuis le succès de la production d’animaux clonés, notamment de souris. Il y a eu plusieurs tentatives pour améliorer l’efficacité de clonage et trichostatine A (TSA), un inhibiteur de deacetylase d’histone, a été largement utilisé pour améliorer l’efficacité du clonage. Nous rapportons ici une méthode de clonage considérablement améliorée chez les souris. Cette méthode de transfert nucléaire de cellules somatiques comporte l’utilisation de virus Hemagglutinating du Japon enveloppe (HVJ-E), qui permet une manipulation facile. En outre, le traitement à l’aide de deux petites molécules, TSA et la vitamine C (VC), avec l’albumine sérique bovine désionisée (dBSA), est très efficace pour le développement embryonnaire. Cette approche nécessite une injection supplémentaire ni manipulations génétiques et présente donc une méthode simple et adaptée pour une utilisation pratique. Cette méthode pourrait devenir une approche techniquement réalisable pour les chercheurs produire des animaux génétiquement modifiés des cellules cultivées. En outre, il pourrait être un moyen utile pour le sauvetage des animaux en voie de disparition par clonage.

Introduction

Le TNCS permet la production d’animaux clonés en utilisant qu’une seule cellule somatique ou un noyau d’être transféré à un ovocyte énucléé. Un des buts de la technique du SNCT est l’obtention de lignées de cellules souches embryonnaires (CSE-NT) transfert de noyaux d’embryons clonés. En 1998, Wakayama et al., déclarée produisant une souris clonée avec succès nommée Cumulina pour la première fois1. Depuis lors, le clonage de souris a été largement étudié, et beaucoup de renseignements importants sur la reprogrammation nucléaire des noyaux somatiques ont été obtenus. En revanche, cette technique est accompagnée de nombreuses étapes de micromanipulation qui sont assez difficiles à maître, nécessitant une formation intensive de plus de 3 mois2.

Production de souris clonées à l’aide de SCNT a évolué de l’original Honolulu méthode1, la méthode électrosoudables3, à la méthode de fusion de cellules par le virus Hemagglutinating du Japon (HVJ)4. Toutefois, l’injection directe d’un noyau de la cellule par le biais de la cytomembranaire a tendance à nuire à la survie ovocytaire. L’électrofusion est faible efficacité, puisque chaque membrane cellulaire a une dureté différente, rendant difficile de déterminer une condition optimale. La manipulation de HVJ est laborieuse car il nécessite des équipements spécifiques pour la sécurité des chercheurs et des animaux de laboratoire. Pour fusionner le cytoplasme cellulaire et ovocytes de donateurs, HVJ-E a récemment utilisé5. HVJ-E n’a la possibilité de fusionner des membranes sans la capacité proliférative ou infectieuse du virus. ARN génomique de HVJ sont complètement inactivée dans HVJ.-E. L’utilisation de HVJ-E supporte ainsi une manipulation facile de la fusion cellulaire au cours de la SNCT.

Plusieurs rapports ont montré que le traitement des embryons obtenus par TNCS avec TSA, un inhibiteur de deacetylase d’histone, améliore considérablement l’efficacité de la production de petits vivants de moins de 1 % à 6,5 %6,7. Traitement de TSA accélère reprogrammation par modification des histones marques d’embryons obtenus par TNCS8. Récemment, l’injection des ARNm particulier, la sous-famille de déméthylase lysine histone 4 (KDM4), qui enlèvent la lysine histone H3 9 (H3K9) triméthylation dans les embryons obtenus par TNCS, surtout dans les régions de reprogrammation-résistant, a été montrée pour augmenter la mise au point de clonés des embryons de souris9. Pendant ce temps, VC, qui sert également un modificateur d’histone, a diminué de triméthylation de H3K910. En outre, VC favorise le développement embryonnaire en porcine TNCS10. Il a été signalé que l’injection de dBSA dans les embryons obtenus par TNCS mène à l’amélioration du développement embryonnaire,11.

Précédemment, nous avons trouvé que la combinaison de petites molécules, à savoir TSA et VC, ainsi que de la dBSA, amélioré considérablement développement d’embryons obtenus par TNCS12. Ici, nous détaillons la méthode TNCS rapportée antérieurement pour les souris, qui représente très efficace et simple clonage procédures12. Nous décrivons également la manipulation de HVJ.-E. Ceux-ci pourraient aider de nombreux chercheurs dans le domaine de la biologie de reproduction et le développement pour préserver les ressources génétiques ou de produire des animaux génétiquement modifiés par le biais de cette méthode par TNCS.

Protocol

Toutes les procédures d’animaux soient conformes aux directives de Kindai Université pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. préparation des milieux de Culture Préparer le milieu modifié de HLGHW (mKSOM) pour la culture de l’embryon, composé de 95 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 0,35 mM KH2PO4, 0,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0. 2 mM D (+)-Glucose, 0,2 mM Pyruvate de Sodium, L-Glutamine, 1,0 g/L de Polyvinylpyrrolidone (PVP), mM 25,07 NaHCO3, 1. 0 mM 10 mM DL-Lactate de Sodium, 0,05 g/L la pénicilline et 0,05 g/L streptomycine dans de l’eau stérile. Préparer le milieu tampon Hepes CZB (HCZB) pour la manipulation de l’embryon, consistant à 81,5 mM NaCl, KCl, 1,7 mM CaCl2 · 4,8 mM 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2na, 36,1 mM DL-Lactate de Sodium, 5,55 mM D (+)-Glucose 0,025 g/mL de pénicilline, streptomycine de 0,035 g/L, 0,014 mM rouge de phénol, alcool polyvinylique 1,0 g/L, 5,0 mM NaHCO3et 20,0 mM Hepes sel de sodium dans de l’eau stérile. Préparer le milieu activation activation ovocytaire : mKSOM additionné à 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µg/mL cytochalasine B (CB) et 5 mM LVERS2. 2. préparation d’eau désionisée albumine de sérum bovin (dBSA) Dissoudre 1.2 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 10 mL d’eau stérile à température ambiante (une concentration finale de 12 %). Ajouter environ 0,12 g de perles de résine échangeuse d’ions mixtes à ce qui précède préparé 12 % de BSA dans de l’eau stérile à la température ambiante en agitant doucement. Quand les perles changent la couleur du bleu-vert à l’or, récupérer le surnageant à l’aide d’une pipette. Puis remplacez les billes avec la fraîche ones (Figure 1).Remarque : Le remplacement des perles est normalement effectué qu’une seule fois. Il faut éventuellement quelques remplacements de désionisation totale. Seulement comme un guide, si la couleur des perles reste inchangée depuis bleu-vert à l’or, il indique que l’échange ionique est terminé. Récupérer la solution après avoir vérifié qu’il n’y a aucun changement de couleur dans les perles.Remarque : Si la solution Récupérée devient trouble, centrifuger pour prévenir le colmatage du filtre (175 x g, 5 min). Compléter le récupéré la solution avec 250 µL de 10,5 % NaHCO3.Remarque : Ce processus est conçu pour la solution de dBSA neutraliser la condition pH. Cependant, NaHCO3 peut être superflue. Stériliser le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 µm et conserver à-20 ° C en solution mère dBSA. 3. ovocyte Collection Remarque : Toutes les souris ont été gardés dans des chambres climatisées et lumière contrôlée. Super-chaque souris femelle de B6D2F1 (âgés de 8 à 10 semaines) l’ovulation par injection intrapéritonéale de 7,5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) et 7,5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) 48 h après l’injection de PMSG. Effectuer l’euthanasie par dislocation cervicale 14-16 h après l’injection d’hCG. Inciser l’abdomen pour accéder à l’appareil reproducteur à l’aide de techniques de dissection standard13. En bref, pincer la peau et faire une petite incision latérale à la ligne médiane avec des ciseaux. Tendez la peau fermement au-dessus et au-dessous de l’incision et tirer la peau vers la tête et la queue. Couper le péritoine à l’aide de ciseaux, pousser les bobines du tube digestif de la route et confirmer la présence de deux cornes de l’utérus, les ovaires et les oviductes. Extirper les oviductes avec petits ciseaux droites et pince à épiler, placer sur une feuille de papier filtre pour essuyer le sang hors de la surface. Définissez les oviductes dans l’huile minérale. Ensuite, couper vers le haut de l’ampoule de l’oviducte à l’aide d’aiguilles de dissection et déplacer les complexes cumulus-ovocytes provenant de l’ampoule de l’oviducte en 200 gouttes µL de milieu HCZB 0,1 % hyaluronidase. Incuber pendant 5 min sur une plaque chauffante.ATTENTION : Une exposition de plus de 10 min dans un milieu HCZB avec 0,1 % hyaluronidase serait néfaste pour les ovocytes. Confirmer que les cellules du cumulus sont rejetés par les complexes cumulus-ovocytes sous un stéréomicroscope, transfert métaphase de la méiose (MII) deuxième étape ovocytes avec certaines cellules du cumulus restant à mKSOM moyen contenant 0,3 % dBSA. Ensuite, laver les ovocytes de scène MII quatre fois par pipetage de haut en bas (à l’aide d’une pipette de < 100 µm de diamètre intérieur) en mKSOM moyenne contenant 0,3 % dBSA pour détacher les cellules restantes de cumulus.Remarque : L’utilisation d’une petite pipette facilite le détachement des cellules cumulus. Incuber les ovocytes stade Mll en mKSOM moyenne contenant 0,3 % dBSA à 37 ° C moins de 5 % CO2 incubateur jusqu’à une énucléation.Remarque : Une petite pipette avec un diamètre légèrement plus grand que celui de l’ovocyte est recommandée. 4. préparation des cellules du donneur pour le transfert de noyaux de Après les étapes de 3,3 à 3,5, ovocytes dénudés sont isolés des complexes cumulus-ovocytes. Transférer une petite quantité (environ 2 µL) les cellules restantes de cumulus dispersées dans des complexes cumulus-ovocytes dans le milieu HCZB avec 0,1 % hyaluronidase au milieu de HCZB avec 6 % dBSA à l’aide d’une pipette sous un stéréomicroscope. Placez les cellules du cumulus dans un milieu HCZB avec 6 % dBSA sur la plaque chauffante à 37 ° C jusqu’au moment de la SNCT.NOTE : Lorsque fibroblastes (par exemple., murin fibroblastes foetale) sont utilisées comme cellules donneuses, détacher les cellules d’un plat de culture de tissus et centrifuger à eux par un plomb. Resuspendre le culot de cellules dans un milieu HCZB contenant 6 % dBSA. 5. l’énucléation d’ovocytes Préparer 9 % PVP milieu en ajoutant 0,9 g PVP à 10 mL de milieu de HCZB et conserver au réfrigérateur pendant la nuit (4 ° C) puis stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Préparer les solutions CB (concentration de 1 mg/mL) en ajoutant 5 mg de CB à 5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer la solution mère de CB avec support HCZB (une concentration finale de 5 µg/mL) et d’utiliser comme solution d’énucléation. Laver les ovocytes de scène Mll dans 20 µL de milieu HCZB contenant 5 µg/mL CB (solution énucléation) par l’inspiration et l’expiration grâce à la pipette stérilisée (diamètre intérieur : 150 µm à 200 µm). Répéter la procédure de nettoyage cinq fois. Attendre environ 10 min sur la plaque chauffante dans la solution de l’énucléation avant de commencer le processus d’énucléation. Préparer la chambre énucléation comme illustré à la Figure 2 a. Transférez les ovocytes de Mll dans la chambre une énucléation de l’inspiration et l’expiration à l’aide de la pipette (diamètre intérieur : 150 µm à 200 µm) ; déposer 4 µL de solution d’énucléation et couvrir la chambre avec de l’huile minérale.Remarque : Au lieu d’une chambre, un couvercle d’une boîte de Pétri de 60 mm peut être utilisé. Identifier les axes et les chromosomes de l’ovocyte de scène MII au microscope (X 400) à température ambiante. Orienter l’ovocyte Mll de scène avec le prononcé premier corps polaire, jusqu’à ce que le positionnement de la broche et le chromosome 3 ou de 09:00 (Figure 2 b) position à l’aide d’une pipette de tenue et de la micropipette.Remarque : Le microscope utilisé a lentilles de grossissement de X 400 au total. En outre, l’objectif N.A est 5 X / 0.12 et 40 X / 0.55. La conduite d’impulsions piezo de la pipette permet un perçage rapide de la zone pellucide. En outre, un système de laser (p. ex., XYClone) est également utilisable pour le forage de la zone pellucide en lieu et place du système de pilotage piezo. La valeur de l’intensité des impulsions piezo à 3-6 et percer à la zone pellucide à l’aide d’une pipette de micromanipulation (7-8 µm de diamètre intérieur plat la pointe) avec l’impulsion piézo-électrique de conduite. Après avoir ouvert un trou dans la zone pellucide, complètement enucleate les axes et les chromosomes avec une quantité minimale de cytoplasme (Figure 2).Remarque : Au cours de ce processus, ovocytes ont tendance à fixer sur le fond du plat étroitement Pipetter en raison de la moyenne sans BSA14. Moins de 10 min, l’énucléation doit être terminée et les ovocytes énucléés ont besoin d’être retourné à l’incubateur. Le nombre d’ovocytes pouvant être manipulés en une énucléation approprié est entre 10 et 20. Pour les plus gros lots d’ovocytes, la procédure de l’énucléation est répétée. Confirmer l’absence de chromosomes présents dans le cytoplasme sous la lumière visible (Figure 2, milieu), puis laver les ovocytes énucléés dans un milieu mKSOM contenant 0,3 % dBSA manque CB. Introduire le plat dans l’incubateur à 37 ° C moins de 5 % de CO2 jusqu’à la fusion cellulaire.Remarque : Après une énucléation, le cytoplasme de l’ooplasme contient les axes et les chromosomes. 6. fusion d’une cellule de donneur et un ovocyte énucléé Préparation de HVJ-E Ajouter 260 µL de solution de suspension glacee HVJ-E à lyophilisée HVJ-E (dans le kit, voir la Table des matières) et Pipeter de haut en bas jusqu’à ce que complètement suspendue.NOTE : La quantité appropriée de lyophilisé HVJ-E est établie dans une bouteille, et 260 µL de solution de suspension HVJ-E est inclus dans le kit. Préparer 5 µL d’extraits de la solution HVJ-E et ensuite stocker à-80 ° C jusqu’à ce que la fusion cellulaire.ATTENTION : Traiter avec soin le HVJ-E sur la glace, car il est sensible à la température. A l’issue de l’expérience, les convenablement autoclave HVJ-E matières et les contenants à inactiver totalement les composants du virus. Fusion cellulaire Diluer le 5 µL de solution de HVJ-E avec 20 µL du tampon fusion cellule immédiatement avant l’emploi. Place de la solution diluée de HVJ-E sur la glace jusqu’à l’utilisation.Remarque : La mémoire tampon la fusion cellulaire est incluse dans le kit de HVJ-E. Préparer la chambre de fusion de cellules, comme illustré à la Figure 3 a. Transférez les ovocytes énucléés au milieu de la HCZB sur la chambre de fusion de cellules à l’aide de la pipette (diamètre intérieur : 150 µm à 200 µm) ; place 4 µL de chaque solution (milieu HCZB contenant 6 % -BSA pour les cellules du donneur, solution HVJ-E, moyen HCZB, 9 % PVP dans le milieu HCZB) et couvrir la chambre avec environ 1 mL d’huile minérale.Remarque : Le nombre d’ovocytes énucléés qui sont transférés à la chambre pour manipulation pendant une procédure de fusion de cellule approprié est de 5 à 30. Pour les plus gros lots d’ovocytes, la procédure de fusion de cellule est répétée. Au lieu de la chambre, un couvercle plat de Pétri de 60 mm peut être utilisé, si elles sont disponibles. Placez les ovocytes énucléés dans un milieu HCZB sous un microscope à 400 X magnificationat température de la pièce. Aspirer les cellules du donneur à l’aide de la pipette de micromanipulation (6-7 µm de diamètre intérieur plat la pointe) et d’expulser des cellules dans la solution de suspension HVJ-E. Puis aspirer des cellules du cumulus un par un avec la solution de suspension HVJ-E d’être également séparé de l’autre, permettant la fusion cellulaire serial. Garder les ovocytes énucléés dans un milieu HCZB à l’aide d’une pipette de l’exploitation. Percer la zone pellucide avec la pipette de micromanipulation avec l’impulsion piézo-électrique (intensité de vitesse 3-6, 2-3). Après avoir ouvert le trou dans la zone pellucide, placez une cellule cumulus étroitement à la membrane de l’ovocyte, ainsi que de la solution de suspension HVJ-E avec un volume de 5 fois le volume d’une cellule de cumulus, sans passer par la membrane de l’ovocyte.NOTE : Préparez 6-7 µm de diamètre intérieur plat pointes de pipettes de micromanipulation cellules du cumulus. Pipettes doivent être lavés régulièrement à l’aide de moyen de 9 % PVP pour maintenir la libération cellulaire lisse. Mesures 6.2.3 – 6.2.5 doivent être terminées en moins de 10 min, ou l’efficacité de la fusion cellulaire sera plus faible. Activité de fusion membranaire de HVJ-E est inactivée par autoclavage, traitement avec un détergent, ou de l’éthanol à 70 %. Après l’expérience, la solution HVJ-E doit être correctement éliminée. Après l’intervention de la fusion cellulaire, rapidement transférer les ovocytes à mKSOM moyen contenant 0,3 % dBSA et déménage dans un incubateur à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 1 h. 7. activation des ovocytes reconstruits et traitement avec trichostatine A et vitamine C Préparation de TSA Diluer la solution TSA 5 mM dans 3 µL d’extraits et de stocker la solution à-20 ° C. Ajouter 2,5 µL de solution mère de TSA de 5 mM à 1 mL de DMSO (une concentration de 12,5 µM). Diluer 8 µL de 12,5 µM TSA solution dans 2 mL d’activation moyen et mKSOM moyen (une concentration finale de 50 nM). Préparation de CV Ajouter 1 mg de VC dans 1 mL d’eau stérile exempt d’endotoxine et conserver à-20 ° C. Ajouter la solution étalon de VC au milieu de la mKSOM (une concentration finale de 10 µg/mL). Activation des ovocytes reconstruits Une heure après la fusion cellulaire, vérifier la condensation chromosomique prématurée (PCC) dans les ovocytes reconstruits (Figure 3 b) à l’aide d’un microscope (X 400). Transférez les ovocytes reconstruits dans le milieu de l’activation (Voir l’étape 1.3) contenant des TSA et incuber pendant 6 heures à 37 ° C moins de 5 % de CO2 dans l’air (Figure 3). Observer la formation de pro-noyaux chez les embryons obtenus par TNCS, puis appliquez 2 plus d’heures de traitement TSA en mKSOM moyenne contenant 0,3 % dBSA (Figure 2). Transférer les embryons traités TSA mKSOM additionné de VC et incuber pendant 7 h, comme indiqué en Figure 3D. Après 7 h du traitement VC, transférer les embryons traités VC à mKSOM moyen contenant 0,3 % dBSA et incuber pendant 4 jours à 37 ° C moins de 5 % de CO2 dans l’air.Remarque : Pour produire des souris clonées, transfert des embryons au stade de 2 cellules morphologiquement normaux dans les oviductes chez des souris femelles enceintes Pseudo-aléatoire (MCH(ICR)) le jour quand un plug vaginal est trouvé (jour 0,5 de Pseudo-grossesse)15. Après 19,5 jours, le nombre de sites d’implantation et les nouveau-nés est enregistré après césarienne.

Representative Results

Pour produire des embryons de souris clonées, cellules du cumulus et fibroblastes foetaux ont été utilisés. Le nombre d’ovocytes reconstruits et développement jusqu’au stade 2 cellules après activation ovocytaire sont indiqués dans le tableau 1. Un taux très élevé de formation pronucléaire (89 à 100 %) et de développement jusqu’au stade 2 cellules (77 à 89 %) ont été observés dans toutes les conditions. Certains des embryons clonés, qui ont dérivé des cellules de cumulus et atteint le stade 2 cellules, ont été transférés à oviductes de femelles gravides Pseudo-aléatoire. Six progéniture clonée de 72 embryons transférés ont été produites de trois femmes enceintes par le traitement série de TSA et VC (Figure 4). Environ 15 % des embryons clonés ont été signalés à développer à terme en suivant cette TNCS procédures12. En outre, le transfert d’embryons clonés de 2 cellules dans d’autres établissements a réalisé des descendants direct de 9 à 15 %, qui représente le meilleur développement que le seul traitement de TSA sur des embryons clonés. En outre, le traitement avec la TSA et VC a considérablement amélioré l’efficacité in vitro développement embryonnaire au stade blastocyste (tableau 2, P < 0,05, test t de Student). Ces données du développement in vitro démontrent que l’effet positif de la TSA et VC est limitée par les souches de souris ni de types de cellules. Ces résultats suggèrent que cette méthode TNCS facilite la capacité du développement des embryons clonés. Figure 1 : Préparation du dBSA.Procédures pas à pas pour la préparation de la solution de dBSA sont représentés. L’étendue de l’échange d’ions peut être jugée par le changement de couleur des perles. La haute figure de gauche montre que 1,2 g de BSA est dissous dans 10 mL d’eau stérile à la température ambiante. Après la dissolution de BSA, les billes de résine échangeuse d’ions sont ajoutés (en haut à droite). Lorsque le mélange de la solution de BSA avec perles de résine échangeuse d’ions changer la couleur du bleu-vert à l’or (bas à droite), remplacer les perles par des neuves. Le chiffre du bas à gauche montre que la couleur des perles reste bleu-vert et échange d’ions est terminé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Procédures d’énucléation.(A) une illustration de la chambre de l’énucléation. Énucléation des ovocytes s’effectue dans le milieu HCZB avec CB. Pour le système de conduite de piezo, une place de milieu PVP de 9 % est utilisée pour préparer la pipette de verre pour une énucléation. Spots sont couverts par des huiles minérales. (B) un diagramme et une micrographie montrent la position des broches et chromosomes avant une énucléation. Noir de pointes de flèches : les axes et les chromosomes. Pointes de flèche rouges : le premier globule polaire. (C), un diagramme et une micrographie de montrer une énucléation réussie. Noir de pointes de flèches : les axes et les chromosomes. Pointe de flèche rouge : le premier globule polaire. Pointe de flèche bleue : le trou dans la zone pellucide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Procédures de fusion de cellules et culture de condition des embryons obtenus par TNCS.(A) une illustration de la chambre de fusion cellulaire. La fusion cellulaire s’effectue dans le milieu HCZB, contenant 6 % dBSA. Une place de milieu PVP de 9 % est utilisée pour préparer la pipette de verre pour fusion cellulaire. Spots sont couverts par des huiles minérales. (B) un diagramme et une micrographie de la condensation chromosomique prématurée ont formé une heure après la fusion cellulaire (flèche noire). (C), un diagramme et une micrographie de la structure pronucléaire forment six heures après l’activation (flèches noires). (D) régime de traitement TSA, VC et dBSA pour les embryons obtenus par TNCS. Flèche verte représente le traitement avec la TSA, suivie d’une incubation avec VC (flèche jaune) sous mKSOM milieu contenant avec 0,3 % dBSA (flèche bleue). Flèches indiquent le moment de changer de milieu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Progéniture clonée dérivée de cellules du cumulus juste après une césarienne après 19,5 jours de grossesse.Il y a placenta à la rangée du haut. La progéniture clonée ci-contre ont été générée dans une expérience de transfert de noyaux de trois mères nourricières. La taille de placenta était de 1,5 à 2 fois plus grande que la taille de ceux produits par fécondation in vitro . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Groupe Type de cellules de donneur Souche de souris N ° d’ovocytes utilisés N ° d’ovocytes fusionnés N ° d’ovocytes montrant condensation chromosomique prématurée N ° d’ovocytes montrant la formation de pronucléi (%) N ° d’ovocytes formés pronucléus qui développapour les embryons de 2 cellules (%) TSA, VC Cumulus C57BL/6 × S/N/2 84 82 82 81 (99) 72 (89) non traitée Cumulus C57BL/6 × S/N/2 84 82 82 82 (100) 68 (83) TSA, VC fibroblaste foetale MCH(ICR)×MCH(ICR) 202 171 169 151 (89) 124 (82) non traitée fibroblaste foetale MCH(ICR)×MCH(ICR) 201 171 147 142 (97) 109 (77) Tableau 1 : effets du traitement TSA et VC sur le à la vitro développement des embryons de souris clonées à l’étape 2-cell. Groupe Type de cellules de donneur Souche de souris Lol des embryons de 2 cellules utilisés Lol des embryons de 2 cellules développées à chaque étapes (%) 4 cellules morula blastocyste TSA, VC Cumulus C57BL/6 × S/N/2 152 152 (100) 149 (98) 135 (89) un non traitée Cumulus C57BL/6 × S/N/2 83 47 (57) 41 (49) 32 (39) b TSA, VC fibroblaste foetale MCH(ICR)×MCH(ICR) 124 110 (89) 101 (81) 88 (71) c non traitée fibroblaste foetale MCH(ICR)×MCH(ICR) 109 54 (50) 45 (41) 29 (27) d a-b, c-d Différents exposants dans les mêmes cellules de donneur représentent des différences significatives (P < 0,05) Tableau 2 : effets du traitement TSA et VC sur le à la vitro développement de l’embryon cloné des souris au stade blastocyste.

Discussion

En conclusion, ces résultats suggèrent que la méthode TNCS présentée pourrait réduire les difficultés techniques et accroître l’efficacité du TNCS sans nécessiter de modifications génétiques et la supplémentation de l’ARNm (tableau 1, tableau 2) et s’assurer production stable d’embryons clonés. Cette méthode nous permet de reconstruire des embryons obtenus par TNCS plus que les méthodes conventionnelles en raison du meilleur taux de survie et protocole simplifié. Dans ce protocole, une étape critique est la fusion cellulaire. Pour réussir à produire des souris clonées, il est essentiel de s’assurer qu’une quantité suffisante de HVJ-E, décrite dans le protocole est maintenue au cours du processus de fusion cellulaire et ovocytes doivent être renvoyé dans l’incubateur à moins de 10 min au cours des étapes 6.2.3 – 6.2.5. Étant donné que 20 à 30 cellules du donneur peuvent être aspirés avec HVJ-E à la fois dans la pipette de la manipulation, le nombre d’ovocytes obtenus en une seule opération est supérieur à celle de la méthode existante. En fin de compte, nous pouvons produire des ovocytes re-construits environ 20 à 30 moins de 10 min. Même en travaillant avec un lot important d’ovocytes (100 ou plus), la procédure de fusion cellulaire devrait prendre une heure ou moins en répétant les étapes 6.2.3 – 6.2.5. La méthode et les techniques présentées ici peuvent servir de protocoles efficaces avec des exigences techniques simplifiées.

À l’heure actuelle, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement des embryons obtenus par TNCS sont toujours pas claires. Cette méthode améliorée de TNCS contribue également à l’étude des mécanismes de reprogrammation, étant donné que cette méthode peut produire plusieurs embryons clonés dans une seule expérience. Cette méthode utilise les cellules somatiques avec des membranes de cellules intactes pour la fusion cellulaire. Ainsi, il peut être possible d’appliquer cette approche à d’autres cellules, tels que la pointe de la queue de16cellules, cellules de sertoli17et18de cellules souches embryonnaires (ES). Lorsque les méthodes conventionnelles de TNCS sont utilisés pour injecter des cellules relativement grandes, telles que les cellules de bout de queue, directement dans le cytoplasme de l’ovocyte, il devient même plus techniquement difficile d’obtenir des embryons vivants. En outre, des cellules relativement durs, comme les cellules de sertoli, sont difficiles à briser par la pipette d’injection. Si l’on considère ces types de cellules, la méthode de fusion de cellules utilisant HVJ-E est simple et efficace. Bien que la valeur et la sécurité de HVJ-E ont été démontrée de façon convaincante19,20, il serait important de réexaminer la possibilité d’utiliser HVJ-E pour les producteurs d’animaux clonés à des fins agricoles ou biomédicales.

En outre, récemment un groupe réussi à produire des souris clonées provenant de l’urine cellules21. Pour sauver les espèces de mammifères en voie de disparition, désormais obtenus par TNCS utilise les cellules recueillies de manière non invasive, comme la cellule de l’urine, sera idéale. Plus récemment, un autre groupe a généré directement souris clonées à l’aide spécifique de l’antigène CD4 des cellules de+ T22. Il serait intéressant d’examiner si cette méthode est également applicable pour cloner efficacement les souris de ces cellules. Par ailleurs, Latrunculine A a été signalé comme une meilleure alternative pour inhiber la polymérisation de l’actine durant une énucléation et parthénogénétique activation du TNCS ovocytes23. Future étude peut révéler si le traitement A Latrunculine, au lieu de cytochalasine B, améliore encore génération de progéniture clonée. En outre, le traitement de la TSA a été utilisé avec succès chez la souris, cochons24et lapins25 en changeant la concentration, période et durée du traitement. En outre, VC non seulement améliore le développement embryonnaire chez les porcins TNCS10, mais améliore également la production de cellules iPS chez les humains et les souris26. Il est donc plausible de spéculer que TSA et VC le traitement peut également être appliqué à d’autres espèces de mammifères, et nous devrons optimiser le temps de traitement des TSA et VC pour chaque espèce.

En conclusion, cette méthode permettrait de générer des souris clonées avec un niveau de pratique d’efficacité avec des procédures simples. Par conséquent, les résultats de cette étude pourraient conduire, nous utilisions le TNCS pour préserver les ressources génétiques des animaux rares et pour comprendre les mécanismes moléculaires de la reprogrammation nucléaire et développement embryonnaire précoce.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par numéros de bourse JSPS KAKENHI JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 à la subvention de la Fondation K.M. Sumitomo pour projets de recherche de sciences fondamentales (150810 de K.M.). Kindai University Research Grant (15-I-2 de K.M. et M.A.). A.m. reconnaître le soutien fondamental de Cancer Research UK (C6946/A24843) et le Wellcome Trust (203144/Z/16/Z).  Nous remercions Mme N. Backes-Kamimura et M. J. Horvat pour lecture de la preuve.

Materials

NaCl Sigma-Aldrich, Co., Lcc. 28-2270-5 For medium
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-03542 For medium
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 165-04242 For medium
MgSO4 · 7H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 137-00402 For medium
CaCl2 · 2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 039-00431 For medium
D(+)-Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595 For medium
Sodium Pyruvate Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 199-03062 For medium
L-Glutamine Sigma-Aldrich, Co., Lcc. G3126 For medium
Polyvinylpyrrolidone Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 168-17042 For medium
NaHCO3 Nacalai tesque, Inc. 31213-15 For medium
Sodium DL-Lactate Nacalai tesque, Inc. 31605-72 For medium
Penicillin Meiji Seika Pharma Co., Ltd. 4987222637671 (GTIN-13) For medium
Streptomycin Meiji Seika Pharma Co., Ltd. 4987222665643 (GTIN-13) For medium
Sterile water, endotoxin free Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-15645 For medium
EDTA · 2Na Dojindo Lab. 345-01865 For medium
Phenol red Sigma-Aldrich, Co., Lcc. P0290 For medium
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich, Co., Lcc. H3784 For medium
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich, Co., Lcc. P8136 For medium
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich, Co., Lcc. A3311 For medium
BT AG 501-X8 (D) Resin Bio-Rad Lab., Inc. 143-7425 For preparation of dBSA
Hyaluronidase Sigma-Aldrich, Co., Lcc. H3506 For collection of oocytes and cumulus cells
Cytochalasin B Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 034-17554 For enucleation and oocytes activation
Piezo micro manipulator Prime tech, Co., Ltd. PMM-150FU For micromanipulation
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF Ishihara sangyo kaisha, Ltd. CF001 Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion
SrCl2 · 6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 193-09442 For oocytes activation
EGTA Sigma-Aldrich, Co., Lcc. E8145 For oocytes activation
Dimethyl sulfoxide Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 045-24511 For solvent
Trichostatin A Sigma-Aldrich, Co., Lcc. T1952 For incubating with SCNT embryos
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich, Co., Lcc. A5960 For incubating with SCNT embryos
Mineral oil Sigma-Aldrich, Co., Lcc. M8410 For covering medium
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References

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Azuma, R., Miyamoto, K., Oikawa, M., Yamada, M., Anzai, M. Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer. J. Vis. Exp. (134), e57036, doi:10.3791/57036 (2018).
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