العلاج التوافيقيه Trichostatin A وفيتامين ج يحسن كفاءة استنساخ الفئران بنقل نواة الخلية الجسدية
Summary
يصف لنا طريقة تحسنت بشكل كبير للاستنساخ الماوس باستخدام تريتشوستاتين أ، وفيتامين ج، والبومين المصل البقري منزوع. علينا إظهار بروتوكول مبسط وقابل لإعادة الإنتاج الذي يدعم تطوير كفاءة الأجنة المستنسخة. ومن ثم، يمكن أن يصبح هذا الأسلوب إجراء موحد لاستنساخ الماوس.
Abstract
نقل نواة الخلية الجسدية (سكنت) يوفر فرصة فريدة من نوعها لإنتاج مباشرة من الحيوانات مستنسخة من خلية مانحة، ويتطلب استخدام تقنيات ماهراً. بالإضافة إلى ذلك، ظلت كفاءات الاستنساخ منخفضة منذ النجاح في إنتاج الحيوانات المستنسخة، ولا سيما الفئران. كانت هناك محاولات عديدة لتحسين كفاءة الاستنساخ، وتريتشوستاتين A (TSA)، مثبط deacetylase هيستون، قد استخدمت على نطاق واسع لتعزيز كفاءة الاستنساخ. هنا، نحن تقرير أسلوب استنساخ تحسنت بشكل كبير في الفئران. ويشمل هذا الأسلوب نقل نواة الخلية الجسدية استخدام فيروس هيماجلوتيناتينج من “اليابان المغلف” (هفج-E)، التي تمكن من السهل التلاعب. وعلاوة على ذلك، العلاج باستخدام اثنين من الجزيئات الصغيرة، حساب السياحة الفرعي وفيتامين ج (VC)، مع ألبومين المصل البقري منزوع (مصرف)، فعالة للغاية للتنمية الجنينية. هذا النهج يتطلب حقن إضافية ولا التلاعب بالجينات، وهكذا يقدم طريقة بسيطة وملائمة للاستخدام العملي. يمكن أن يصبح هذا الأسلوب نهجاً ممكناً من الناحية الفنية للباحثين لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا من الخلايا المستزرعة. وعلاوة على ذلك، قد يكون وسيلة مفيدة لإنقاذ الحيوانات المهددة بالانقراض عن طريق الاستنساخ.
Introduction
تمكن تقنية سكنت إنتاج الحيوانات المستنسخة باستخدام واحد فقط من الخلية الجسمية أو نواة لنقلها إلى البويضيه enucleated. واحد لأغراض تقنية سكنت هو الاشتقاق خطوط الخلايا الجذعية الجنينية (NT-بتوليدا) النقل النووي من أجنة مستنسخة. وفي عام 1998، واكاياما et al.، والإبلاغ عن إنتاج الفأرة مستنسخة بنجاح المسمى كومولينا ل المرة الأولى1. ومنذ ذلك الحين، استنساخ الفئران قد تم دراستها على نطاق واسع، وتم الحصول على العديد من معلومات هامة بشأن إعادة برمجة النووي لنواة جسدية. من ناحية أخرى، هذا الأسلوب هو مصحوبة بالعديد من الخطوات ميكرومانيبوليشن التي يصعب جداً للأصول الرأسمالية، التي تتطلب تدريبا مكثفا لأكثر من 3 أشهر2.
إنتاج الفئران المستنسخة باستخدام سكنت تطورت من الأصلي هونولولو الأسلوب1، أسلوب الصهر الكهربائي3، إلى أسلوب الانصهار الخلية بالفيروس هيماجلوتيناتينج من اليابان (هفج)4. ومع ذلك، يميل الحقن المباشر لنواة الخلية عن طريق سيتوميمبراني ضاراً تؤثر على بقاء البويضات. الصهر الكهربائي منخفض في الكفاءة، ونظرا لكل غشاء الخلية صلابة مختلفة، مما يجعل من الصعب تحديد شرط أمثل. التعامل مع هفج شاقة لأنها تتطلب معدات خاصة لسلامة الباحثين والحيوانات المختبرية. فتيل السيتوبلازم الخلية والبويضات المانحين، هفج ه في الآونة الأخيرة تستخدم5. هفج ه فقط لديه القدرة على صهر الأغشية دون قدرة الفيروسات التكاثري أو المعدية. الكشف هفج الجينوم معطلة تماما في هفج-هاء. وهكذا يدعم استخدام هفج ه سهولة التعامل من الانصهار الخلية أثناء سكنت.
وقد أظهرت عدة تقارير أن معاملة الأجنة سكنت مع حساب السياحة الفرعي، مثبط deacetylase هيستون، تحسن كبير في كفاءة الإنتاج الجراء حية من أقل من 1% إلى 6.5%6،7. حساب السياحة الفرعي العلاج يسرع إعادة برمجة عن طريق تعديل علامات هستون في الأجنة سكنت8. في الآونة الأخيرة، حقن خاصة مرناس، الفصيلية ديميثيلاسي يسين هيستون 4 (KDM4)، التي تقوم بإزالة هيستون H3 ليزين 9 (H3K9) تريميثيليشن في الأجنة سكنت، لا سيما في مناطق ريبروجرامينج-مقاومة، لقد ثبت لزيادة تطوير المستنسخة ماوس الأجنة9. ومن ناحية أخرى، انخفض الاستثمار الرأسمالي، الذي يعمل أيضا كمعدل هستون، تريميثيليشن H3K910. وعلاوة على ذلك، يعزز الاستثمار الرأسمالي التطور الجنيني في الخنزير سكنت10. وأفيد أن حقن مصرف في الأجنة سكنت يؤدي إلى تحسين التنمية الجنينية11.
لقد وجدنا سابقا أن مجموعة الجزيئات الصغيرة، إلا وهي السياحة والاستثمار الرأسمالي، جنبا إلى جنب مع مصرف، جذريا تعزيز التنمية سكنت الأجنة12. هنا، نحن بالتفصيل طريقة سكنت سبق الإبلاغ عنها للفئران، التي تمثل إجراءات الاستنساخ كفاءة عالية وبسيطة12. ونحن أيضا وصف معالجة هفج-هاء وهذه يمكن أن تساعد العديد من الباحثين في مجال البيولوجيا الإنجابية والتنموي المحافظة على الموارد الوراثية أو إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا من خلال هذا الأسلوب سكنت.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي الختام، هذه النتائج تشير إلى أن الطريقة التي سكنت قدم يمكن تقليل الصعوبات التقنية، وزيادة كفاءة سكنت دون الحاجة إلى التعديلات الوراثية ومكملات مرناً (الجدول 1و الجدول 2)، وضمان استقرار إنتاج أجنة مستنسخة. هذا الأسلوب يتيح لنا إعادة إعمار الأجنة سكنت أكثر من الأساليب التقليدية نظراً لمعدل البقاء على قيد الحياة أفضل وبروتوكول مبسط. في هذا البروتوكول، وهو خطوة حاسمة واحدة خلية الانصهار. لإنتاج الفئران المستنسخة بنجاح، أنها حيوية لضمان أن يتم الاحتفاظ بكمية مناسبة من هفج الإلكترونية المبينة في البروتوكول أثناء عملية الانصهار الخلية وبويضات بحاجة إلى أن تعاد إلى الحاضنة داخل 10 دقيقة خلال الخطوات 6.2.3-6.2.5. حيث يمكن أن يستنشق الخلايا المانحة 20 إلى 30 جنبا إلى جنب مع هفج ه في وقت واحد في ماصة التلاعب، أكبر من الأسلوب الحالي عدد بويضات تم الحصول عليها خلال عملية واحدة. وفي النهاية، نحن يمكن أن تنتج بويضات أعيد بناؤها حوالي 20 إلى 30 في 10 دقيقة. حتى عندما تعمل مع مجموعة كبيرة من بويضات (100 أو أكثر)، خلية الانصهار الإجراء ينبغي أن تأخذ ساعة أو أقل بتكرار الخطوات 6.2.3-6.2.5. بالأسلوب والتقنيات المعروضة هنا يمكن اعتبارها البروتوكولات الكفء مع المتطلبات التقنية المبسطة.
وفي الوقت الحاضر، أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير الأجنة سكنت لا تزال غير واضحة. كما يساهم هذا الأسلوب سكنت تحسين دراسة آليات إعادة برمجة هذه، وبهذه الطريقة يمكن أن تنتج العديد من الأجنة المستنسخة في تجربة واحدة فقط. يستخدم هذا الأسلوب خلايا جسدية مع أغشية سالمة من خلية لخلية الانصهار. وهكذا، قد يكون من الممكن لتطبيق هذا النهج إلى خلايا أخرى مثل الخلايا نصيحة ذيل16، خلايا سيرتولي17، والخلايا الجذعية الجنينية (ES)18. عندما تستخدم الأساليب التقليدية سكنت لحقن الخلايا الكبيرة نسبيا، مثل الخلايا نصيحة الذيل، مباشرة في السيتوبلازم البويضات، يصبح حتى من الناحية الفنية أكثر تطلبا للحصول على الأجنة الحية. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الثابتة نسبيا، مثل خلايا سيرتولي، يصعب على الخروج من بيبيتينج للحقن. عند النظر في هذه الأنواع المختلفة من الخلية، أسلوب الانصهار الخلية استخدام هفج ه بسيطة وفعالة. على الرغم من أن قيمة وسلامة هفج ه قد تم إثبات مقنع19،20، قد يكون هاما إعادة النظر في جدوى استخدام هفج ه لإنتاج الحيوانات المستنسخة للأغراض الزراعية أو الطبية.
وعلاوة على ذلك، أنتجت مجموعة واحدة مؤخرا بنجاح الفئران المستنسخة المستمدة من الخلايا البول21. لإنقاذ أنواع الثدييات المهددة بالانقراض، من الآن فصاعدا سكنت استخدام الخلايا التي يتم جمعها بطريقة غير الغازية، مثل الخلية البول، سوف تكون مثالية. في الآونة الأخيرة، مجموعة أخرى مباشرة قد ولدت الفئران المستنسخة باستخدام خلايا CD4 محددة مستضد الخلايا+ ر22. سيكون من المثير للاهتمام أن تفحص إذا كان هذا الأسلوب ينطبق أيضا على كفاءة استنساخ الفئران من هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، أبلغ A لاترونكولين كبديل أفضل لتثبيط بلمرة الأكتين أثناء انوكلييشن والتنشيط بارثينوجينيتيك سكنت بويضات23. دراسة في المستقبل قد تكشف عما إذا كانت معاملة A لاترونكولين، بدلاً من سيتوتشالاسين ب، يحسن كذلك جيل نسل المستنسخة. بالإضافة إلى ذلك، معاملة حساب السياحة الفرعي قد استخدمت بنجاح في الفئران والأرانب25 الخنازير24بتغيير وقت العلاج والفترة والتركيز. وعلاوة على ذلك، الرأسمالي يعزز من التنمية الجنينية في الخنزير سكنت10، بل أيضا يحسن إنتاج خلايا iPS في البشر والفئران26. وبالتالي، فمن المعقول التكهن بأن معاملة حساب السياحة الفرعي والرأسمالي يمكن أن تطبق أيضا على سائر أنواع الثدييات، وإننا قد نحتاج إلى تحسين وقت المعالجة للسياحة والاستثمار الرأسمالي لكل نوع من الأنواع.
وفي الختام، هذا الأسلوب سيجعل من الممكن توليد الفئران المستنسخة بمستوى عملي من الكفاءة مع إجراءات بسيطة. ولذلك، نتائج هذه الدراسة يمكن أن تؤدي بنا إلى استخدام التكنولوجيا سكنت للحفاظ على الموارد الوراثية للحيوانات النادرة، وفهم الآليات الجزيئية لإعادة برمجة النووي والتنمية الجنينية المبكرة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل كاكينهي JSPS منحة أرقام JP15H06753، JP16H01321، JP16H01222، JP17H05045 على منحة من مؤسسة سوميتومو ك. م. “مشاريع بحوث العلوم الأساسية” (150810 إلى ك. م.). منحة بحثية في جامعة كينداي (15-I-2 ك. م. وشهادة الماجستير). مو تقر بالدعم الأساسية المقدمة من المملكة المتحدة “لأبحاث السرطان” (C6946/A24843) ومؤسسة ويلكوم ترست (203144/Z/16/Z). ونشكر السيدة أ. باك-كاميمورا، والسيد J. هورفات لدليل على القراءة.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
- Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
- Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
- Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
- Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
- Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
- Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
- Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
- Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
- Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).
- Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
- Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. . Manipulating the mouse embryo. , (1986).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
- Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
- Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
- Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
- Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
- Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
- Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).
- Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
- Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
- Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).
