Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

Wenn B-Zellen zu binden polarisierten Arrays von Antigenen (z.B., angezeigt auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs)), der daraus resultierenden B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung Laufwerke die Entstehung einer klassischen immun Synapse Struktur, die erstmals in beschrieben T Zellen^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13}. Zunächst Mikrokügelchen Antigen gebunden BCR Form an der Peripherie der B-Zelle: APC-Kontakt-Seite. Diese Mikrokügelchen bewegen sich dann in Richtung der Mitte der Antigen-Kontakt-Seite, wo sie verschmelzen zu einem zentralen supramolekularen Aktivierung-Cluster (cSMAC), die den Kern der immun Synapse bildet. Immun Synapse Bildung optimiert BCR Signalisierung und erleichtert die BCR-vermittelten Antigen-Extraktion aus der APC-Membran-¹⁴. Diese Antigen-Akquisition, die BCR-vermittelten Antigen Internalisierung und anschließende Antigen Verarbeitung folgt, kann B-Zellen zu präsentieren Peptid: MHC-II-komplexe, T-Zellen und T-Zell-Hilfe-¹⁴zu entlocken. Da immun Synapse Bildung fördert B-Zell-Aktivierung, Aufklärung der Mechanismen, die festlegen, dass diese funktionalen Muster der Rezeptor Organisation neu bieten kann sind Einblicke wie Humorale Immunantwort eingeleitet und geregelt.

Reorganisation der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons ist essentiell für immun Synapse Bildung. Lokalisierte BCR Signalisierung angeregt durch eine räumlich-polarisierten Arrays von Antigenen induziert rasche und drastische Umgestaltung der Aktin-Zytoskelett^1,15. Die Bildung von dendritischen Aktin-Strukturen an der Peripherie der B-Zellen übt Druck Kräfte auf die Plasmamembran und fördert die Verbreitung von B-Zellen. Dies ermöglicht die B Zelle, einen größeren Bereich des Antigen-Auflagefläche zu scannen, und erhöht die Anzahl der BCR, die Antigen binden und BCR Signalwege aktivieren. Zur gleichen Zeit sind die MTOC und Mikrotubuli-Netzwerk neu ausgerichtet auf dem Gelände der Antigen-Kontakt. Während die MTOC der Antigen-Kontakt-Seite nähert, verlängern Mikrotubuli, die aus der MTOC entlang der Innenseite der Plasmamembran an der Schnittstelle zwischen der B-Zelle und Antigen tragenden Fläche^16,17. Diese Juxtamembrane Mikrotubuli können dann als Titel für die dynien-vermittelten zentripetalen Bewegung der Antigen-gebundenen BCR Mikrokügelchen¹⁸, was zur Bildung einer cSMAC handeln.

Die Neuausrichtung und die Polarisation des MTOC gegenüber immun Synapse erfordert intakte Actin und Mikrotubuli Cytoskeletons und hängt oft von Wechselwirkungen zwischen der kortikalen Aktin Netzwerk und Mikrotubuli^{16,17, 19,20}. Kortikale Actin-bindende Proteine, wie IQGAP1, können Mikrotubuli erfassen, durch die Interaktion mit Proteinkomplexe, die Mikrotubuli Plus-enden²¹schmücken. Diese dynamische komplexe Plus-Ende-bindende Proteine gehören EB1 und CLIP-170, die gemeinsam als Mikrotubuli Plus-tracking-Proteine (+ Tipps)^21,22End bezeichnet werden. + Spitzen an den Enden der Mikrotubuli können Proteine binden, die die Plasmamembran oder der kortikalen Aktin-cytoskelett zugeordnet sind. Dies ermöglicht Kraft erzeugenden Mechanismen (z.B.Minus-Ende gerichtet Bewegung des cortically verankert dynien entlang der Mikrotubuli) Zugkräfte auf Mikrotubuli ausüben, und positionieren dabei die MTOC. CLIP-170 kann binden an das Protein Aktin-assoziierten Gerüst IQGAP1²³, und wir haben gezeigt, dass beide dieser Proteine für MTOC BCR-Induzierte Polarisation in Richtung immun Synapse¹⁷erforderlich sind. Diese IQGAP1-CLIP-170-Interaktion kann eine wichtige Rolle bei der Koordinierung der Umbau des Aktin-Zytoskeletts mit der Neupositionierung des Mikrotubuli-Netzwerks an der B-Zelle immun Synapse spielen.

Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie hat die dramatische Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons während B-Cell immun Synapse Bildung²ergeben. Dieser Ansatz kann nicht jedoch kleine zelluläre Strukturen im Detail durch die Beugungsgrenze des Lichts, aufgelöst, die nach dem Abbeschen Gesetz abhängig von der Wellenlänge des Lichts verwendet ist, um die Probe und die Blende der Objektive²⁴beleuchten. Diese Beugungsgrenze schränkt die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopen, 200-300 nm in seitlicher Richtung und 500-700 nm in axialer Richtung²⁵. Daher kleinere subzellulären Strukturen, sowie die feinen Details der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons konnten nur beobachtet werden mit Elektronenmikroskopie. Elektronenmikroskopie-Bildgebung des Zytoskeletts ist zeitaufwendig, erfordert harte Probe Fixierung und Vorbereitung Protokolle, die biologische Strukturen zu verändern, und beschränkt sich auf Antikörper-vermittelten Erkennung. Die Fähigkeit, Immunostain und gleichzeitig Bild mehrere Proteine oder zelluläre Strukturen stellt einen wesentlichen Vorteil der Fluoreszenz-Mikroskopie. Darüber hinaus mit dem Ausdruck fluoreszierende Schmelzverfahren Proteine in den Zellen ermöglicht Echtzeit-Bildgebung und ist nützlich, wenn wirksame Antikörper für Immunostaining Protein des Interesses nicht verfügbar sind.

Jüngsten technologischen Fortschritte in der Super-Auflösung Mikroskopie überwinden Sie die Grenzen der Beugung des Lichts und erlaubt die Visualisierung von nanoskaligen Zellstrukturen²⁴. Eine solche super-Resolution-Mikroskopie-Technik heißt stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie. STED beschäftigt zwei Lasern, wo ein Laser regt das Fluorophor und ein zweiten Lasers mit einem Donut-förmigen Muster gezielt unterdrückt die Fluoreszenz-Emission um das Fluorophor. Dies reduziert die Point-Spread Funktion (scheinbare Bereich) ein einzelnes fluoreszierende Partikel und bietet ein Sub Beugung Begrenzung fluoreszierende Bild^25,26. Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie beschäftigt auch Fluoreszenz-basierte Techniken zu Super-Auflösung erwerben. Aber die Bild-Erwerb und Wiederaufbau-Zeiten sind längst gibt es nur eine begrenzte Anzahl von Fluorophore, die verwendet werden können und die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung des Zytoskeletts mehrere Komponenten ist technisch anspruchsvoll, da die Verwaltung Aktin und Mikrotubuli Strukturen erfordert unterschiedliche Fixierung Verfahren. Daher STED hat mehrere Vorteile gegenüber der Elektronenmikroskopie und anderen Super-Auflösung Mikroskopie nähert sich, dass es schnelle Bildakquisition bietet, minimale Nachbearbeitung Anforderungen hat und setzt die gleichen Fluorophore und Färbetechniken für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie von örtlich festgelegten Proben²⁶genutzt werden.

Super-Auflösung Mikroskopie wurde jetzt verwendet, um Aktin-Strukturen an der immun Synapse in natürlichen killer (NK)-Zellen und T Zellen^{26,27,28,29,30,} visualisieren ³¹. jedoch Höchstauflösung Bildgebung des Mikrotubuli-Zytoskeletts sowie die koordinierte Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons bei immun Synapse Bildung, wurde erst vor kurzem berichteten¹⁷. B-Bildzellen, die verteilt auf Deckgläsern beschichtet mit Anti-Immunglobulinen (Anti-Ig) Antikörper, die stimulieren, BCR Signalisierung und initiieren Zytoskelett Reorganisation durfte früher STED-Mikroskopie. Wenn auf immobilisierten Antikörper Anti-Ig verchromt, durchlaufen B-Zellen dramatische Aktin-abhängige verbreiten, die rekapituliert die ursprünglichen Ereignisse während immun Synapse Bildung. Wichtig ist, offenbart STED-Mikroskopie die feinen Details der dendritischen Ring der F-Aktin, die Formen an der Peripherie des Immunsystems synapse und zeigte, dass die MTOC sowie die Mikrotubuli befestigt ist, in der Nähe der Antigen-Kontakt-Seite¹⁷bewegt hatte. Diese Mikrotubuli verlängert nach außen in Richtung der Peripherie Ring des F-Aktin. Multi-Color STED Bildgebung verschiedener Kombinationen von F-Actin, Tubulin, IQGAP1, und GFP-markierten CLIP-170 + Tipps Ferner ergab, dass Mikrotubuli Plus-enden gekennzeichnet durch CLIP-170-GFP eng verbunden mit der peripheren Aktin-Geflecht und IQGAP1, waren ein kortikale Erfassung Protein¹⁷.

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für imaging-Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der immun Synapse mit STED-Mikroskopie. Diese Methoden wurden optimiert mit der A20 murinen B-Zell-Linie, die am meisten beschäftigt war, für das Studium BCR Signal- und immun Synapse Bildung^{17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39}. weil kommerzielle Antikörper auf CLIP-170 gut für Immunostaining in früheren Experimenten nicht funktioniert, beschreiben wir ausführlich die Expression von GFP-markierten CLIP-170 in A20 Zellen zusammen mit Färbung Protokolle zur Visualisierung von gleichzeitig bis zu drei Zellskelett Komponenten oder Zytoskelett-assoziierte Proteine. Methoden für die Verwendung von STED-Mikroskopie, Bild Aktin an NK Zelle immun Synapsen wurden⁴⁰beschrieben. Hier reichen wir dies Höchstauflösung multi-Color-Bilder von der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons in B-Zellen zu erwerben.

Eine kritische Betrachtung für die Höchstauflösung Mikroskopie nutzt die entsprechende Fixierung-Verfahren für die Aufrechterhaltung der Zellstrukturen und vermeiden von Schäden an fluoreszierenden Proteinen. Die Fixierung und Färbung hierin vorgestellten Methoden wurden optimiert, um GFP Fluoreszenz zu behalten und bieten hochauflösende Bildgebung der Aktin und Mikrotubuli. Wenn fluoreszierende Proteine zum Ausdruck zu bringen, sollte angemerkt werden, dass B-Zellen in der Regel schwer zu transfizieren. Mithilfe dieses Protokolls 20-50 % von A20 express Zellen in der Regel den transfizierten GFP Fusionsprotein, und unter dieser Bevölkerungsgruppe sind die Ebenen der Proteinexpression variabel. Trotzdem super-Resolution Imaging von Aktin und Mikrotubuli, die mit den Verfahren, die wir beschreiben ist recht robust und qualitativ hochwertige Bilder sind leicht erhältlich. Trotz ihrer geringen Größe im Verhältnis zu A20 Zellen zeigen wir, dass diese Verfahren auch verwendet werden können, zum Bild der Mikrotubuli-Netzwerk im primären B-Zellen, die kurz mit Lipopolysaccharid (LPS) aktiviert wurden. Wir haben gezeigt, dass LPS aktiviert primäre B-Zellen mit siRNA mit relativ hohem Wirkungsgrad (d. h.so, dass Protein Erschöpfung durch Immunoblotting nachgewiesen werden kann), transfiziert werden können so dass sie eine gute Alternative zu der Verwendung von B-Zell-Linien für einige Studien ¹⁷.