تصور أكتين وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي في المشبك محصنة خلية ب استخدام الفحص المجهري استنفاد (STED) حفز الانبعاثات

عند ربط الخلايا ب الاستقطاب صفائف مستضدات (مثلاً، عرض على سطح عرض مستضد الخلايا (Apc))، مستقبلات ب-الخلية الناتجة (المركز) مما يشير إلى تشكيل بنية المشبك محصنة ضد الكلاسيكية، الذي كان أول وصف في محركات الأقراص تي الخلايا^{1،2،3،4،5،6،،}من^{78،9،10، 11،،}من¹²¹³. في البداية، ميكروكلوستيرس نموذج بكرس مستضد زمنياً في المحيط الموقع الاتصال ب الخلية: آسيا والمحيط الهادئ. ثم نقل هذه ميكروكلوستيرس نحو مركز الموقع مستضد الاتصال، حيث أنهم بلورتها في تنشيط supramolecular وسط كتلة (كسماك) الذي يشكل جوهر المشبك محصنة. يحسن المركز مما يشير إلى تشكيل المشبك محصنة ويسهل استخراج مستضد المركز بوساطة من الغشاء APC¹⁴. يسمح هذا الاستحواذ مستضد، التي تبعتها مستضد المركز بوساطة التدخيل وتجهيز مستضد اللاحقة، خلايا ب تقديم الببتيد: MHC المجمعات الثاني لخلايا تي، والتماس مساعدة خلية T¹⁴. ونظرا لأن يعزز تشكيل المشبك محصنة تنشيط الخلية ب، توضيح الآليات التي تنشئ يمكن توفير هذا النمط الوظيفي للمنظمة مستقبلات جديدة ثاقبة الاستجابات المناعية خلطيه كيف بدأت تنظم.

إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء أمر ضروري لتشكيل المشبك محصنة. يدفع المركز مترجمة إشارات تحفزها مجموعة الأقطاب مكانياً من مولدات المضادات سريعة ودرامية يعيد البناء من^1،سيتوسكيليتون أكتين¹⁵. تشكيل هياكل أكتين الجذعية في محيط الخلية بتمارس قوي دفع في غشاء البلازما ويعزز نشر الخلية ب. هذا يسمح للخلية بالي مسح مساحة أكبر من سطح مستضد الحاملة، ويزيد عدد بكرس التي تربط المستضد وتنشيط المركز مما يشير إلى مسارات. في الوقت نفسه، بعد وشبكة ميكروتوبولي بتوجيه نحو موقع الاتصال مستضد. مع اقتراب بعد الموقع الاتصال مستضد، microtubules المنبثقة عن بعد تمتد على طول الوجه الداخلي لغشاء البلازما في مجال التفاعل بين الخلية ب و تحمل مستضد السطح^16،17. ثم يمكن أن تعمل هذه ميكروتوبوليس جوكستاميمبراني كمسارات للحركة المركزي دينين بوساطة مستضد زمنياً بنك ميكروكلوستيرس¹⁸، مما يؤدي إلى تشكيل كسماك.

إعادة توجيه والاستقطاب من بعد نحو المشبك المناعي يتطلب أكتين سليمة وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي، وغالباً ما يعتمد على التفاعل بين الأكتين القشرية الشبكة وميكروتوبوليس^{16،17، ،}من ¹⁹²⁰. يمكن التقاط القشرية البروتينات أكتين-ملزمة، مثل IQGAP1، ميكروتوبوليس من خلال التفاعل مع البروتين المجمعات التي تزين نهايات الجمع microtubule²¹. وتشمل هذه المجمعات الحيوية للبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة EB1 ومقطع-170، التي يشار إليها مجتمعة وصفه ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية تتبع البروتينات (+ نصائح)^21،22. + يمكن ربط نصائح في نهايات microtubules البروتينات المرتبطة بغشاء البلازما أو cytoskeleton أكتين القشرية. هذا يسمح لآليات توليد القوة (مثلاً، الناقص-النهاية توجيه حركة دينين كورتيكالي ترتكز على طول microtubules) بذل سحب القوات في ميكروتوبوليس ومن ثم تغيير موضع بعد. ربط البروتين السقالات المرتبطة أكتين IQGAP1²³قصاصة-170، وقد أظهرنا أن كلا من هذه البروتينات مطلوبة من أجل الاستقطاب الناجم عن المركز بعد نحو المشبك محصنة ضد¹⁷. هذا التفاعل IQGAP1-القصاصة-170 قد تلعب دوراً رئيسيا في تنسيق إعادة عرض cytoskeleton الأكتين مع إعادة تنظيم شبكة microtubule في المشبك محصنة ب-الخلية.

وكشفت مجهرية الفلورية التقليدية المثيرة إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك محصنة خلية ب². ومع ذلك، لا يمكن حل هذا النهج الهياكل الخلوية الصغيرة بالتفصيل بسبب الحد حيود الضوء، الذي، وفقا للقانون لأبي، ويعتمد على الطول الموجي للضوء المستخدمة لإلقاء الضوء على العينة وفتحه موضوعية²⁴. يقيد هذا الحد حيود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية إلى 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي و 500-700 نانومتر في اتجاه محوري²⁵. ولذلك، سوبسيلولار هياكل أصغر حجماً، فضلا عن التفاصيل الدقيقة سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، يمكن فقط ملاحظة باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني. التصوير بالميكروسكوب الإلكتروني سيتوسكيليتون هو مضيعة للوقت، ويتطلب عينة قاسية وتثبيت وإعداد البروتوكولات التي يمكن أن تغير الهياكل البيولوجية، ويقتصر على الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة. القدرة على إيمونوستاين وفي نفس الوقت صورة بروتينات متعددة أو الهياكل الخلوية ميزة كبيرة للفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار في الخلايا يتيح التصوير في الوقت الحقيقي ومفيد عندما لا تتوفر الأجسام المضادة الفعالة ل immunostaining بروتين الفائدة.

الأخيرة التقدم التكنولوجي في مجال مجهرية فائقة القرار التغلب على حدود حيود الضوء والسماح لهم التصور من النانو الهياكل الخلوية²⁴. مثل أسلوب مجهرية فائقة القرار واحد يسمى مجهرية استنفاد (STED) حفز الانبعاثات. وتوظف STED اثنين من أشعة الليزر، حيث ليزر واحد يثير في فلوروفوري وليزر ثانية مع نقش على شكل دونات بشكل انتقائي يمنع انبعاث fluorescence حولها فلوروفوري. هذا يقلل من انتشار نقطة الدالة (منطقة الظاهرة) من الجسيمات الفلورية واحد ويوفر حيود الفرعية حد صورة فلورسنت^25،26. كما تستخدم استنزاف الأرض-دولة مجهرية التقنيات المستندة إلى الأسفار للحصول على صور فائقة الدقة. ومع ذلك، مرات اقتناء والتعمير في الصورة طويلة وهناك عدد محدود فقط من فلوروفوريس التي يمكن استخدامها والتصوير عالي الدقة المتزامنة من عدة مكونات cytoskeletal يمثل تحديا تقنيا للحفاظ على هياكل أكتين و microtubule يتطلب إجراءات مختلفة من التثبيت. ولذلك، STED مزايا متعددة أكثر من المجهر الإلكتروني ونهج أخرى مجهرية فائقة القرار حيث أنه يوفر الحصول على الصور السريعة، ولديه الحد الأدنى من متطلبات تجهيز، وتوظف فلوروفوريس نفسه وتلطيخ تقنيات التي يتم استخدامها الفلورية التقليدية الفحص المجهري لعينات ثابت²⁶.

الآن وقد استخدم مجهرية فائقة القرار لتصور الهياكل أكتين على المشبك المناعي في الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعي وتي الخلايا^26،27،،من^{2829،30، 31}-بيد تصوير القرار فائقة من سيتوسكيليتون ميكروتوبولي، وكذلك تنسيق إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك المناعية، إلا في الآونة الأخيرة عنها¹⁷. كنا مجهرية STED الصورة ب الخلايا التي كان قد سمح لتنتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، مما حفز المركز الإشارات والشروع في عملية إعادة التنظيم cytoskeleton. عندما مطلي على الأجسام المضادة-Ig المعطل تداولها، خلايا ب الخضوع درامية أكتين-تعتمد على الانتشار، الذي يلخص الأحداث الأولى أثناء تشكيل المشبك محصنة. الأهم من ذلك، الفحص المجهري STED كشف التفاصيل الدقيقة لعصابة الجذعية من أكتين و أشكال في المحيط المناعة المشبك وأظهرت أن بعد، فضلا عن microtubules المرتبطة به، قد انتقلت قريبة من موقع الاتصال مستضد¹⁷. هذه microtubules الموسعة إلى الخارج نحو الحلقة المحيطية من أكتين و. وعلاوة على ذلك، تصوير STED متعدد الألوان من توليفات مختلفة من F-أكتين، توبولين، IQGAP1، ومعلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 + نصائح بينت أن microtubule زائد-ينتهي تميزت CLIP-170-التجارة والنقل ارتباطاً وثيقا مع meshwork أكتين الطرفية، ومع IQGAP1، التقاط القشرية البروتين¹⁷.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتصوير سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي في المشبك محصنة ضد استخدام الفحص المجهري STED. وقد تم تحسين هذه الأساليب باستخدام الخط مورين بالخليه A20، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة المركز الإشارات والمشبك محصنة ضد تشكيل^17،،من^3233،،من^{3435 , 36 , 37 , 38 , 39}-نظراً لأن الأجسام المضادة التجارية إلى القصاصة-170 لا تعمل جيدا بالنسبة إيمونوستاينينج في التجارب السابقة، يصف لنا بالتفصيل التعبير عن معلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 في الخلايا A20، جنبا إلى جنب مع تلطيخ البروتوكولات لتصور في نفس الوقت تصل إلى ثلاثة مكونات cytoskeletal أو البروتينات المرتبطة سيتوسكيليتون. أساليب لاستخدام STED المجهري للصورة أكتين في ناغورني كاراباخ الخلايا المناعية نهايات منذ الموصوفة سابقا⁴⁰. هنا، نحن تمديد هذا للحصول على صور متعددة الألوان فائقة القرار سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء في الخلايا ب.

يتم استخدام أحد الاعتبارات الهامة مجهرية فائقة القرار إجراءات التثبيت المناسبة للحفاظ على الهياكل الخلوية ومنع الأضرار بالبروتينات الفلورية. لقد تم تحسين التثبيت وتلطيخ الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة الاحتفاظ بالأسفار التجارة والنقل وتوفير تصوير عالي الدقة من شبكات أكتين وميكروتوبولي. عند التعبير عن البروتينات الفلورية، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا ب يصعب عادة ترانسفيكت. استخدام هذا البروتوكول، 20-50% من A20 يعرب الخلايا عادة البروتين فيوجن التجارة والنقل ترانسفيكتيد وبين هذه الفئة من السكان هي مستويات البروتين التعبير المتغير. ومع ذلك، تصوير فائقة القرار أكتين وميكروتوبوليس باستخدام الإجراءات التي يمكننا وصف قوية جداً وهي سهولة الحصول على صور عالية الجودة. وعلى الرغم من صغر حجمها بالنسبة إلى الخلايا A20، نظهر أن هذه الإجراءات يمكن أيضا استخدامها لصورة الشبكة ميكروتوبولي في الخلايا ب الأولية التي قد تم تفعيلها بإيجاز مع lipopolysaccharide (LPS). وقد أظهرنا أن لبس تنشيط الخلايا ب الابتدائي يمكن تكون transfected مع سيرناس في كفاءة عالية نسبيا (أي، مثل أن نضوب البروتين يمكن الكشف عنها بواسطة immunoblotting)، يجعلها بديلاً جيدا لاستخدام خطوط الخلايا ب لبعض الدراسات ¹⁷.