Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için
Summary
Bu kağıt amacı farklı beyaz yağ dokuları fareler toplamak, yağ örnekleri işlemek ve RNA ayıklamak için bir adım adım yordam sunmaktır.
Abstract
Çoğunlukla lipidler içerdiğinden diğer dokulara karşılaştırıldığında, beyaz yağ dokusu gibi gerçek zamanlı PCR ve Western Blot, karşıdan akış uygulamaları için bir önemli ölçüde daha az RNA ve protein içeriği vardır. Ek adımlar bu lipitlerin önlemek için gerektiğinde RNA izolasyon yağ dokusu örneklerinden de meydan okuyor. Burada, bu örnekler işlemek ve RNA izolasyon gerçekleştirmek için fare üç anatomik olarak farklı beyaz yağ dokuları toplamak için bir yordam mevcut. Biz daha fazla gerçek zamanlı PCR kullanarak cDNA ve gen ifade deneyleri sentezi tarif. Burada açıklanan protokol hayvanın saç ve kan yağ yastıkları yanı sıra doku toplama sırasında farklı yağ yastıkları arasında çapraz bulaşma kirlenme azalma sağlar. Bu da yeterli miktar ve çıkarılan RNA kalitesini sağlamak için optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı nerede yağ doku örnekleri gerçek zamanlı PCR gibi rutin deneyler için gerekli olan herhangi bir fare modeli için yaygın olarak uygulanabilir ama birincil adiposit hücre kültürü izolasyonu için uygun değildir.
Introduction
Obezite tip 2 diyabet1gibi komplikasyonlara yol açabilir bir dünya çapında salgın var. Obezite ve onun ilişkili komplikasyonlar diyet kaynaklı obez ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri araştırma için sık kullanılır. Geleneksel olarak, beyaz yağ dokuları aşırı enerji için bir saklama bölmesi olarak bilinir ve kahverengi yağ dokusu enerji ısı2,3içine dönüştürünceye çoğunlukla lipidler oluşur. Yağ dokusu dinamiktir ve genişletilir ve gıda alımı ve fiziksel aktivite gibi birçok faktöre bağlı olarak küçültme. Bu nedenle, bu değişiklikler için katkıda bulunan etkenleri belirlemek için yeterli yağ dokusu toplama ve işleme gerekli4vardır.
Beyaz yağ dokular arasında subkutan ve viseral yağ depoları anatomik Lokalizasyon gibi farklı özelliklere sahip ve2,5işlev genel olarak kabul. Bu nedenle, çelişkili sonuçlar veya büyük değişkenlik önlemek için dikkat yağ yastıkları toplarken farklı bu yağ depoları arasında çapraz bulaşma önlemek için alınması gerekir.
Dahası, RNA veya protein fareler beyaz Yağ dokusundan izole zaman üç önemli sorunlar vardır. Farklı beyaz yağ depoları birbirinden ayıran sınır her zaman açık, diğer organlar böbrekler ve kalp6gibi aksine değildir gibi ilk olarak, obez farelerde yağ yastıkları toplama kolay bir iş değil. İkinci olarak, protein veya RNA izolasyon sırasında yağ dokusu yüksek lipid içeriği nedeniyle lipidler tabakası üst yüzen ve örnek için doğrudan erişimi engeller. Üçüncü olarak, kahverengi yağ dokusu veya diğer dokularda aksine, beyaz yağ dokusu önemli ölçüde daha düşük RNA ve protein içeriğe sahip ve bu genç fare kullanırken büyük endişe kaynağıdır, fareler bir normal (N) diyet beslenen ve için beklenen fareler var düşük yağ kütlesi (Yani KO modelleri, ilaçlar, tedavi egzersiz eğitim, vb.) 7 , 8.
Bu nedenle, RNA Yağ dokusundan izole etmek için uygun olan yöntemi seçimi önemlidir. Fenol/kloroform ayıklama için alternatif yöntemler ticari kitleri vardır. Onlar genellikle RNA arıtma tarafından takip sütun9tarihinde bir ilk fenol ayıklama adım temel alır. Ancak, bu kitleri normalde daha pahalı olduğunu ve RNA kalitesi değişken olabilir ise daha düşük verim, örnekleri vermek ama daha az zaman alıcı. Ancak, burada açıklanan fenol çözüm/kloroform çıkarma için en büyük avantajlarından biri RNA, DNA ve protein bir tek örnek10izole imkanı vardır. Çünkü fareler yağ yastıkları genellikle küçük ve RNA ve proteinler küçük miktar (özellikle yalın fare modellerinde) vermek, bu protokoller bir küçük bir örnek dışarı alabilirsiniz veri en üst düzeye çıkarmak.
Bu kağıt amacı üç fare beyaz yağ dokusu depoları hem de miktar ve RNA izolasyon kalitesi yeterli örnek koleksiyonundan emin olmak için bir yöntem ayrıntılı olarak tarif etmektir. Bu iletişim kuralı takip ederek elde RNA gerçek zamanlı PCR deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı kültürlü birincil adiposit RNA izolasyonu için tasarlanmamıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aşağıdaki HF-diyet, beslenme obez fareler vücut ve beyaz yağ dokusu ağırlık N diyet beslenen fareler için karşılaştırıldığında artmıştır bulunmuştur. Fenol çözüm kullanarak çıkarılan RNA iyi saflığı ile örnekleri vermiştir. Leptin öncelikle yağ dokusu tarafından üretilen bir adipokine ve olumlu fat kitle16ile ilişkilendirmek için bilinir. Beklendiği gibi leptin mRNA ifade obez farelerde concomitance onların yağ kitlesi ile artmıştır.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser diyabet Kanada tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
