Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA
Summary
O objetivo deste trabalho é apresentar um procedimento passo a passo para coletar os diferentes tecidos adiposo brancos de ratos, processar as amostras de gordura e extrair o RNA.
Abstract
Comparado a outros tecidos, tecido adiposo branco tem um teor consideravelmente menos RNA e proteína para aplicações a jusante, tais como a PCR em tempo real e Western Blot, desde que em sua maioria contém lipídios. Isolamento de RNA a partir de amostras de tecido adiposo é também um desafio como etapas adicionais são necessárias para evitar esses lipídios. Aqui, apresentamos um procedimento para coletar três anatomicamente diferentes brancos adiposo tecidos de ratos, para processar estas amostras e realizar o isolamento de RNA. Podemos descrever a síntese do cDNA e gene experimentos de expressão usando PCR em tempo real. O protocolo descrito por este meio permite a redução da contaminação de cabelo e sangue nas almofadas de gordura, bem como a contaminação cruzada entre diferentes almofadas de gordura durante a coleta de tecido do animal. Ele também foi otimizado para garantir adequada quantidade e qualidade do RNA extraído. Este protocolo pode ser amplamente aplicado a qualquer modelo de rato onde as amostras de tecido adiposo são necessárias para experimentos de rotina, tais como a PCR em tempo real, mas não deve ser isolada da cultura de células primárias de adipócitos.
Introduction
A obesidade é uma epidemia mundial que pode levar a complicações, tais como o tipo 2 diabetes1. Modelos animais induzida por dieta obesos e geneticamente modificados são frequentemente usados para investigação em obesidade e suas complicações associadas. Tradicionalmente, o tecido adiposo branco é conhecido como um compartimento de armazenamento para o excesso de energia e é principalmente composto de lipídios enquanto marrom tecido adiposo converte energia em calor2,3. Tecido adiposo é dinâmico e irá expandir e encolher dependendo de vários fatores tais como a ingestão de alimentos e atividade física. Portanto, para determinar os fatores que contribuem para essas alterações, manipulação e coleta adequada de tecido adiposo são necessários4.
Entre os brancos os tecidos adiposos, é geralmente aceite que os depósitos de gordura subcutâneos e viscerais possuem diferentes propriedades como localização anatômica e função2,5. Por conseguinte, para evitar resultados conflitantes ou grande variabilidade, atenção deve ser tomado para evitar a contaminação cruzada entre estes depósitos de gordura diferentes quando coletando almofadas de gordura.
Além disso, existem três grandes desafios quando isolando RNA ou proteína do tecido adiposo de ratos brancos. Primeiro, coletar almofadas de gordura em ratos obesos não é uma tarefa fácil como a fronteira que separa diferentes depósitos de gordura brancos nem sempre é clara, em contraste com outros órgãos como rins e coração6. Em segundo lugar, por causa do alto teor lipídico do tecido adiposo, durante o isolamento do RNA ou proteína, uma camada de lipídios flutua no topo e impede o acesso direto à amostra. Em terceiro lugar, em vez de marrom tecido adiposo ou outros tecidos, tecido adiposo branco tem consideravelmente mais baixo conteúdo de RNA e proteína e isso é de grande preocupação quando usando ratos jovens, ratos alimentados com uma dieta normal de (N) e ratos que deverão tem baixas gordura massas (ou seja, KO modelos, tratamento com medicamentos, exercem, treinamento, etc.) 7 , 8.
Portanto, escolher o método apropriado para isolar o RNA do tecido adiposo é crítico. Métodos alternativos para extração fenol/clorofórmio são jogos comerciais. Eles normalmente são baseados em uma etapa de extração do fenol inicial, seguida de purificação de RNA em uma coluna de9. No entanto, esses kits são tipicamente mais caros e dar amostras de rendimento mais baixo, enquanto a qualidade do RNA pode ser variável mas são menos demorados. No entanto, uma das maiores vantagens para extração de solução/clorofórmio fenol descrito aqui é a possibilidade de isolar o DNA, RNA e proteína de uma única amostra10. Desde almofadas de gordura de ratos são geralmente pequenas e dar uma quantidade pequena de RNA e proteínas (especialmente em modelos do rato magra), estes protocolos maximizam os dados um pode tirar uma pequena amostra.
O objetivo deste trabalho é descrever detalhadamente um método para garantir a coleta de amostra adequada de depósitos de tecido adiposo branco três ratos, bem como a quantidade e a qualidade da isolação do RNA. RNA obtido seguindo este protocolo pode ser usado para realizar ensaios PCR em tempo real. Este protocolo não se destina para isolamento de RNA de adipócitos primários culturas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seguir HF-dieta alimentar, ratos obesos foram encontrados para ter aumentado o corpo e os pesos de tecido adiposo branco em comparação com ratos alimentados com uma dieta de N. RNA extraído usando solução de fenol rendeu amostras com boa pureza. Leptina é uma adipokine primeiramente produzido pelo tecido adiposo e é conhecida por correlacionar-se positivamente com a massa gorda16. Como esperado, a expressão de RNAm de leptina aumentou em ratos obesos em concomitância com sua massa gorda.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Canadá de Diabetes.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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