Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura
Summary
El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.
Abstract
El circuito del marcapasos circadiano orquesta rítmicas salidas conductuales y fisiológicas coordinadas con señales ambientales, tales como ciclos de día/noche. El reloj molecular dentro de cada neurona de marcapasos genera ritmos circadianos en la expresión génica, que subyacen a las funciones neuronales rítmicas esenciales para el funcionamiento del circuito. Investigación de las propiedades de los osciladores moleculares individuales en diferentes subclases de las neuronas marcapasos y su interacción con la señalización neuronal produce una mejor comprensión del circuito del marcapasos circadiano. Aquí, presentamos un enfoque de Time-lapse microscopia fluorescente desarrollado para controlar el mecanismo molecular en las neuronas reloj del culto cerebro larvas de Drosophila . Este método permite la grabación de varios día de los ritmos de reporteros circadianos fluorescentes genéticamente codificados en resolución unicelular. Esta configuración puede combinarse con manipulaciones farmacológicas a analizar de cerca la respuesta en tiempo real del reloj molecular para varios compuestos. Más allá de los ritmos circadianos, este método polivalente en combinación con potentes técnicas de genética de la Drosophila ofrece la posibilidad de estudiar diversos procesos neuronales o moleculares en el tejido vivo cerebral.
Introduction
Relojes circadianos ayudan a los organismos para adaptarse a los cambios ambientales periódicos generados por la rotación de 24 h de la tierra. Los circuitos de retroalimentación transcripcional y traduccional enclavijado comúnmente subyacen la maquinaria molecular de los relojes circadianos a través de especies1. El circuito del marcapasos circadiano compuesto de reloj que contiene neuronas integra información de hora del día, transmitido por las señales ambientales, como luz/oscuridad (LD) y ciclos de temperatura, a coordinar los ritmos de una plétora de diario fisiológico y procesos conductuales2,3. La coordinación de ritmos moleculares neuronales entradas y salidas es críticamente importante para el funcionamiento del circuito circadiano pero sigue siendo sólo parcialmente entendida.
En Drosophila, en el centro del reloj molecular, el heterodímero/ciclo de reloj (CLK/CYC) activa la transcripción del período (por) y timeless (tim). PER y TIM forman un complejo y entrar en el núcleo, donde inhiben la actividad transcripcional de CLK/CYC y en consecuencia su propia transcripción. Reglamentos postranscripcional y poste-de translación causan retrasos entre CLK/CYC-mediada por transcripción y represión por / TIM, asegurando la generación de alrededor de 24-h oscilaciones moleculares1,3,4 . Unos 150 neuronas que contiene estos relojes moleculares forma un circuito para control circadiano comportamiento de adulto vuela5. Un mucho más simple pero totalmente funcional circadiano circuito que consiste en 3 grupos de neuronas reloj – 5 las neuronas laterales ventrales (LNvs; 4 LNvs PDF-positivo y uno negativo PDF LNv, ver abajo), 2 Dorsal neurona 1 (DN1s) y 2 2s Dorsal de neuronas (DN2s) – está presente en las larvas cerebro de6,7.
El simple circuito circadiano larvas ofrece un excelente modelo para estudiar las interacciones entre la comunicación inter neuronal y el mecanismo molecular. Usando nuestro nuevo reportero fluorescente por TDT, que imita los niveles de proteína y su localización subcelular, se intentó caracterizar la dinámica de la mecánica molecular en subgrupos de reloj diferentes neuronas en el circuito circadiano larvas 8. conocer el papel fundamental del factor de dispersión de pigmento neuropéptido (PDF) producido por 4 LNvs en la regulación de los ritmos circadianos en el nivel neuronal9,10,11, además, queríamos examinar el directo efecto de PDF sobre los relojes moleculares. Para ello, se desarrolló un método para controlar la expresión de genes circadianos ritmos en cerebro larvas presentaron durante varios días por microscopia confocal Time-lapse. El protocolo fue adaptado también para que Ensayos farmacológicos probar el efecto de PDF u otros compuestos en el nivel de la por-TDT. Así, la adaptación consiste en hacer accesible al uso de la droga la cultura de explante de cerebro, aumentando la resolución temporal y proyección de imagen para una duración más corta.
Ex vivo la cultura del cerebro de Drosophila de diferentes etapas de desarrollo han sido previamente establecidas12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando que estos protocolos se han utilizado para la proyección de imagen distintos fenómenos biológicos, algunos de ellos no son compatibles con la proyección de imagen en resolución unicelulares o no apoyo la cultura por más de varias horas. Métodos alternativos para realizar proyección de imagen a largo plazo de vivo de neuronas circadianas en Drosophila incluyen proyección de imagen de bioluminiscencia de ritmos molecular19,20,21 y proyección de imagen de fluorescencia de indicador de calcio con microscopia de luz hoja22,23. Aunque proyección de imagen de bioluminiscencia puede conseguir mayor resolución temporal y microscopía de luz de hoja puede ser adaptable para proyección de imagen en vivo , están limitadas en la resolución espacial y requieren sistemas especializados de microscopio.
El método descrito aquí está diseñado para visualizar señales fluorescentes en la cultura de todo el cerebro unicelular resolución durante varios días. Este método fácil y versátil puede adaptarse a cerebros de mosca adulta imagen cultivada y para experimentos farmacológicos estudiar diferentes problemas en Neurobiología de la Drosophila .
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos el método de largo plazo de microscopía de fluorescencia Time-lapse de cerebros larvas cultivados. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, tales como la salud de la cultura, método para la inmovilización del explante de cerebro, la intensidad de fluorescencia y relación señal a ruido de la reportera, temporal y resolución espacial, y accesibilidad para el explante. Estos factores pueden ser mutuamente excluyentes. Por ejemplo, aumento de frecuencia de lapso de tiemp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Michael Rosbash por su asesoría y apoyo durante la fase inicial del desarrollo de este método. Este trabajo fue financiado por el PRESTO JST programa, la Fundación Nacional Suiza de ciencia (31003A_149893 y 31003A_169548), el Consejo Europeo de investigación (ERC-StG-311194), Fundación Novartis para la investigación biomédica médica (13A39) y la Universidad de Ginebra .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
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