Одноклеточных резолюции флуоресценции живут изображений дрозофилы суточного часов в культуре личиночной мозга
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в создании ex vivo дрозофилы личиночной мозга культуры оптимизированы для мониторинга суточного молекулярной ритмы с долгосрочным флуоресценции покадровой изображений. Также обсуждается применение этого метода для фармакологических проб.
Abstract
Контуре суточного кардиостимулятор оркеструет художественной поведенческие и физиологические выходы, координироваться с экологическими подсказки, например циклов день/ночь. Молекулярные часы, в течение каждого нейрона кардиостимулятор генерирует циркадные ритмы в экспрессии генов, которые лежат в основе художественной нейрональных функций, необходимых для функционирования схемы. Исследование свойств индивидуальных молекулярных осцилляторов в различные подклассы кардиостимулятор нейронов и их взаимодействие с нейронов сигнализации дает, лучшего понимания контуре суточного кардиостимулятора. Здесь мы представляем покадровой флуоресцентной микроскопии подход, разработанный для мониторинга молекулярных заводной будильник нейронов культивировали дрозофилы личиночной мозга. Этот метод позволяет записывать многодневные ритмов генетически закодированный флуоресцентные суточного Репортеры разрешением одной ячейки. Эта установка может сочетаться с фармакологическими манипуляции внимательно анализировать реального времени отклика молекулярных часов для различных соединений. За пределами циркадные ритмы этот универсальный метод в сочетании с мощным дрозофилы генетических методов дает возможность для изучения различных нейронов или молекулярных процессов в живой мозговой ткани.
Introduction
Суточный часы помогают организмов приспособиться к периодических изменений в окружающей среде, порожденных 24 h вращения Земли. Блокируемые transcriptional поступательные обратной часто лежат в основе молекулярного механизма суточного часы различных видов1. Контуре суточного кардиостимулятор состоит из будильник содержащих нейронов интегрирует время день информацию, передаваемую по экологической подсказки, например Светлый/темный (LD) и температурных циклов, чтобы организовать ритмы множество ежедневных физиологические и поведенческих процессов2,3. Координация молекулярных ритмов с нейронов входов и выходов является критически важное значение для функционирования суточного цепи, но остается лишь отчасти понятными.
В дрозофилы, суть молекулярные часы, гетеродимера такт (CLK/CYC) активирует транскрипцию период (за) и вневременной (Тим). % И Тим образуют комплекс и введите ядра, где они подавляют транскрипционный анализ деятельности CLK/CYC и, следовательно, свои собственные транскрипции. POST-transcriptional и столб-поступательные правила приводят к задержкам между CLK/CYC-опосредованной транскрипции и репрессии, % / Тим, обеспечение поколения около 24-h молекулярных колебаний1,3,4 . Около 150 нейронов, содержащие эти молекулярные часы форме схемы управления суточного поведение взрослых мух5. Гораздо проще, но полностью функциональный суточного цепь состоит из 3 групп нейронов будильник – 5 вентральной боковых нейронов (окн; 4 PDF-позитивных окн и один LNv PDF-отрицательные, см. ниже), 2 спинной нейрон 1s (DN1s) и 2 спинной нейрон 2s (DN2s) – присутствует в личиночной мозг6,7.
Простой личинок суточного цепи предлагает отличную модель для изучения взаимодействия между нейронные связи и молекулярных заводной. С помощью нашего недавно разработанных флуоресцентные репортер %-TDT, который имитирует уровни на белок и расположению субклеточном, мы стремились охарактеризовать динамику молекулярных заводной в разные часы нейрон подгрупп в контуре личиночной суточный 8. Кроме того, зная ключевую роль нейропептида пигмент диспергирующие фактора (PDF), производимые 4 окн в регулировании циркадные ритмы в нейрональных уровня9,10,11, мы хотели бы изучить прямой влияние PDF на молекулярные часы. С этой целью мы разработали метод мониторинга суточного ген выражение ритмы в личиночной мозга explant через несколько дней, покадровой confocal микроскопии. Протокол также был адаптирован для фармакологических проб для проверки эффекта PDF или других соединений на уровне %-TDT. Таким образом адаптация состоит из доступности культуры экспланта мозга для применения наркотиков, увеличение временного разрешения и изображений на более короткий срок.
Ex vivo культуры дрозофилы мозги различных этапов развития были ранее установленных12,13,14,,1516,17 ,18. Эти протоколы используются для визуализации различных биологических явлений, в то время как некоторые из них не совместимы с изображений разрешением одной ячейки или не поддерживают культуру для более чем несколько часов. Альтернативные методы для выполнения долгосрочных живых изображений суточного нейронов в дрозофилы включают биолюминесценции изображений молекулярной ритмы19,,2021 и флуоресценции изображений кальция индикатор с легкими лист микроскопии22,23. Хотя биолюминесценции изображений можно добиться более высоких временное разрешение и легких лист микроскопии могут быть адаптированы для изображений в естественных условиях , они ограничены на пространственное разрешение и требуют специализированных Микроскоп систем.
Метод, описанный здесь предназначена для визуализации флуоресцентные сигналов в культуре весь мозг в резолюции одноклеточных в течение нескольких дней. Этот снисходительный и универсальный метод может быть адаптирована для взрослых летать мозги культурный образ и фармакологические эксперименты для изучения многих различных проблем в области нейробиологии дрозофилы .
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описал метод для долгосрочного покадровой микроскопии флуоресцирования культивировали личиночной мозги. Успех такого рода экспериментов зависит от нескольких факторов, например, здравоохранения, культуры, метод для иммобилизации экспланта мозга, интенсивности флуоресценц?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Майкла Rosbash за его наставничества и поддержки на начальном этапе разработки этого метода. Эта работа финансировалась программой JST PRESTO, Швейцарский Национальный научный фонд (31003A_149893 и 31003A_169548), Совет Европы исследований (ERC-StG-311194), фонд Новартис лечебно-биомедицинских исследований (13A39) и Женевского университета .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?. Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 – Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila’s circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O’Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
