Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

Horloges circadiennes aident les organismes à s’adapter aux changements environnementaux périodiques générées par la rotation de 24h de la terre. Les boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel contrefil communément sous-tendent la machinerie moléculaire des horloges circadiennes ensemble espèce¹. Le circuit de pacemaker circadien composé horloge contenant des neurones intègre time-of-day information véhiculée par les signaux environnementaux, tels que la lumière/obscurité (LD) et les cycles de température, d’orchestrer les rythmes d’une pléthore de quotidien physiologique et les processus comportementaux^2,3. La coordination des rythmes moléculaires avec neuronales entrées et sorties est cruciale pour le fonctionnement du circuit circadien, mais reste que partiellement compris.

Chez la drosophile, au cœur de l’horloge moléculaire, l’hétérodimère/CYCLE d’horloge (CLK/CYC) active la transcription de la période (par) et intemporels (tim). PER et TIM forment un complexe et entrer dans le noyau, où ils inhibent l’activité transcriptionnelle de CLK/CYC et, par conséquent, leur propre transcription. Règlement post-transcriptionnelle et post-traductionnelles entraînent des retards entre CLK/CYC-mediated transcription et de la répression par p. / TIM, assurer la génération de circa oscillations moléculaires 24 h^1,3,4 . Environ 150 neurones contenant ces horloges moléculaires forme un circuit de contrôle circadien comportement d’adulte vole⁵. Un beaucoup plus simple et entièrement fonctionnelles circadiens circuit composé de 3 groupes de neurones de l’horloge – 5 neurones latérale ventrale (LNvs ; 4 LNvs PDF-positif et un négatif PDF LNv, voir ci-dessous), 2 dorsales neurone 1 s (DN1s) et 2 dorsales neurone 2 s (DN2s) – est présent dans les larves cerveau^6,7.

Le circuit circadien larvaire simple offre un excellent modèle pour étudier les interactions entre la communication inter neuronale et l’horloge moléculaire. À l’aide de notre reporter fluorescent nouvellement mis au point par-TDT, qui imite les niveaux de protéine et sa localisation subcellulaire, nous avons cherché à caractériser la dynamique de la mécanique moléculaire en sous-groupes de neurone horloge différentes dans le circuit circadien larvaire ⁸. en outre, connaissant le rôle essentiel du facteur de dispersion de pigment neuropeptide (PDF) produit par 4 LNvs dans la régulation des rythmes circadiens au niveau neuronal^9,10,11, nous avons voulu examiner le direct effet de PDF sur les horloges moléculaires. À cette fin, nous avons développé une méthode pour contrôler l’expression des gènes circadiens rythmes dans cerveau larvaire explant sur plusieurs jours en Time-lapse microscopie confocale. Le protocole a été également adapté pour les essais pharmacologiques tester l’effet de PDF ou d’autres composés sur le niveau de p.-TDT. Ainsi, l’adaptation se compose de vulgariser la culture d’explants de cerveau à la demande de drogue, d’augmenter la résolution temporelle et d’imagerie pour une durée plus courte.

Ex vivo culture de Drosophila cerveau des différentes étapes du développement ont été établies auparavant^{12,13,14,15,16,17 ,},¹⁸. Considérant que ces protocoles ont été utilisés pour l’imagerie des différents phénomènes biologiques, certains d’entre eux ne sont pas compatibles avec la formation image à résolution unicellulaire ou ne supportent pas la culture pendant plus de quelques heures. Des méthodes alternatives pour effectuer une imagerie live à long terme des neurones circadiennes chez la drosophile incluent l’imagerie bioluminescence des rythmes moléculaires^19,20,21 et imagerie de fluorescence de indicateur de calcium avec nappe de lumière microscopie^22,23. Bien que l’imagerie de bioluminescence peut atteindre une résolution temporelle plus élevée et la microscopie de nappe de lumière peut être adaptable pour l’imagerie in vivo , ils sont limités à la résolution spatiale et exigent des systèmes spécialisés de microscope.

La méthode décrite ici est adaptée pour visualiser les signaux fluorescents dans la culture de cerveau entier à cellule unique résolution sur plusieurs jours. Cette méthode facile et polyvalente pourrait être adaptée à cervelle de mouche adulte image cultivée et d’expériences pharmacologiques d’étudier de nombreux problèmes différents en neurobiologie de la drosophile .