Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Circadiane klokken helpen organismen aan te passen aan de periodieke veranderingen in het milieu die zijn gegenereerd door de 24u draaiing van de aarde. De interlocked transcriptionele-translationeel feedbacklussen vaak ten grondslag liggen de moleculaire machine van circadiane klokken over soorten¹. Het circuit van de circadiane pacemaker bestaat uit de klok-bevattende neuronen integreert tijd van de dag informatie overgebracht door middel van de ecologische signalen, zoals de licht/donker (LD) en temperatuur cycli, om te orkestreren de ritmes van een overvloed aan dagelijks fysiologische en gedragsmatige processen^2,3. De coördinatie van de moleculaire ritmes met neuronale inputs en outputs is uitermate belangrijk voor de werking van de circadiane circuit maar blijft slechts ten dele begrepen.

In Drosophila, de kern van de moleculaire klok, de klok/cyclus (CLK/CYC) heterodimer activeert de transcriptie van periode (per) en tijdloze (tim). PER TIM vormen een complex en voeren de kern, waar ze transcriptionele activiteit van CLK/CYC en daarmee hun eigen transcriptie remmen. Post-transcriptional en posttranslationele verordeningen veroorzaken vertragingen tussen CLK/CYC-gemedieerde transcriptie en repressie door PER / TIM, zorgen voor de generatie van circa 24 uur moleculaire oscillaties^1,3,4 . Ongeveer 150 neuronen die deze moleculaire klokken-formulier bevat vliegt een circuit tot controle circadiane gedrag van volwassene⁵. Een veel eenvoudiger maar volledig functionele circadiane circuit dat bestaat uit 3 groepen van neuronen van de klok – 5 ventrale laterale neuronen (LNvs; 4 PDF-positieve LNvs en één PDF-negatieve LNv, zie hieronder), 2 dorsale Neuron 1s (DN1s) en 2 dorsale Neuron 2s (DN2s) – is aanwezig in het larvale hersenen^6,7.

Het eenvoudige larvale circadiane circuit biedt een uitstekend model voor het bestuderen van de interacties tussen Inter neuronale communicatie en de moleculaire uurwerk. Met behulp van onze nieuw ontwikkelde fluorescerende verslaggever PER-TDT, die de hoeveelheid PER eiwit en haar subcellular locatie bootst, wilde wij karakteriseren de dynamiek van de moleculaire uurwerk in verschillende klok neuron subgroepen in het larvale circadiane circuit ⁸. Bovendien, te weten de sleutelrol van de neuropeptide pigment-dispersing factor (PDF) geproduceerd door 4 LNvs bij het reguleren van de circadiane ritmen bij de neuronale niveau^9,10,11, we wilden onderzoeken van de directe effect van de PDF op de moleculaire klokken. Te dien einde ontwikkelden we een methode voor het controleren van de circadiane genexpressie ritmes in larvale hersenen over meerdere dagen door time-lapse confocale microscopie explant. Het protocol is ook aangepast voor farmacologische testen om te testen van het effect van PDF of andere verbindingen op het niveau van de PER-TDT. Dus, de aanpassing bestaat uit de hersenen explant cultuur toegankelijk maken voor toepassing van de drug, verhoging van de temporele resolutie en imaging voor een kortere duur.

Ex vivo cultuur van Drosophila hersenen van verschillende ontwikkelingsstadia geweest tevoren vastgelegde^{12,13,14,15,16,17 ,18}. Overwegende dat deze protocollen zijn gebruikt voor imaging-verschillende biologische fenomenen, sommige van hen zijn niet compatibel met beeldvorming bij eencellige resolutie of bieden geen ondersteuning voor de cultuur voor meer dan enkele uren. Alternatieve methoden voor het uitvoeren van langdurige live beeldvorming van circadiane neuronen in Drosophila omvatten bioluminescentie beeldvorming van moleculaire ritmes^19,20,21 en fluorescentie beeldvorming van calcium-indicator met licht blad microscopie^22,23. Hoewel bioluminescentie imaging hogere temporele resolutie bereiken kan en lichte blad microscopie aangepast voor in vivo imaging worden kan, ze zijn beperkt op de ruimtelijke resolutie en vereisen gespecialiseerde Microscoop systemen.

De hier beschreven methode is toegesneden op het visualiseren van fluorescerende signalen in de hele hersenen cultuur bij eencellige resolutie over meerdere dagen. Deze facile en veelzijdige methode kan worden aangepast naar afbeelding gekweekte volwassen vliegen hersenen en farmacologische experimenten veel verschillende problemen in Drosophila neurobiologie te bestuderen.