Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية المورفولوجية في الدماغ اليرقات الثقافة
Summary
والهدف من هذا البروتوكول إنشاء ثقافة الدماغ اليرقات السابقين فيفو المورفولوجية الأمثل لرصد إيقاعات الجزيئية الإيقاعية مع المدى الطويل fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير. وتناقش أيضا تطبيق هذا الأسلوب لفحوصات الدوائية.
Abstract
دائرة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية ينظم الإيقاعي النواتج السلوكية والفسيولوجية منسقة مع إشارات بيئية، مثل دورات اليوم/ليلة. ساعة جزيئية داخل كل تنظيم ضربات القلب العصبية يولد إيقاعات circadian في التعبير الجيني، التي تكمن وراء الإيقاعي وظائف الخلايا العصبية اللازمة لعمل الدائرة. التحقيق في خصائص التذبذب الجزيئية الفردية في مختلف أقسام فرعية لتنظيم ضربات القلب من الخلايا العصبية وتفاعلها مع الإشارات العصبية غلة فهم أفضل لتنظيم ضربات القلب الإيقاعية الدائرة. نقدم هنا، نهجاً الوقت الفاصل بين الفحص المجهري نيون لرصد البرتقالة الجزيئية في الخلايا العصبية على مدار الساعة لمثقف المورفولوجية اليرقات الدماغ. يسمح هذا الأسلوب تسجيل عدة أيام من إيقاعات الصحفيين الإيقاعية الفلورسنت وراثيا مرمزة في القرار خلية واحدة. يمكن أن يكون هذا الإعداد جنبا إلى جنب مع المعالجات الدوائية لتحليل استجابة في الوقت الحقيقي على مدار الساعة الجزيئية للمركبات المختلفة عن كثب. خارج إيقاعات circadian، يقدم هذا الأسلوب متعدد الأغراض في تركيبة مع التقنيات الجينية المورفولوجية القوية إمكانية دراسة العمليات العصبية أو الجزيئية المختلفة في أنسجة الدماغ حية.
Introduction
الساعات الإيقاعية تساعد الكائنات الحية على التكيف مع التغييرات البيئية الدورية الناتجة عن دوران الأرض ح 24. عادة وراء حلقات متداخلة ردود الفعل النسخي متعدية الآلية الجزيئية للساعات الإيقاعية نطاق الأنواع1. تتألف الدارة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية المحتوية على مدار الساعة الخلايا العصبية يدمج معلومات الوقت من اليوم تنقلها العظة البيئية، مثل الضوء/الظلام (دينار) ودورات درجة الحرارة، تنسق الإيقاعات من عدد كبير صحيفة الفسيولوجية و العمليات السلوكية2،3. تنسيق إيقاعات الجزيئية مع الخلايا العصبية المدخلات والمخرجات من الأهمية بمكان لتشغيل الدائرة الإيقاعية لكن يظل مفهوما جزئيا فقط.
في المورفولوجية، في صميم عقارب الساعة الجزيئية، ينشط هيتيروديمير ساعة/دورة (CLK/الفتوة) النسخ من الفترة (الواحد) و زمان (تيم). تشكل مجمعا في وتيم وإدخال النواة، حيث أنها تكبح النشاط الترانسكربتي CLK/الفتوة، ونتيجة لذلك النسخ الخاصة بهم. أنظمة بوستترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال يسبب التأخير بين النسخ CLK/الفتوة-التوسط والقمع من جانب في/تيم، ضمان توليد سيركا ذبذبات الجزيئية 24-ح1،،من34 . حوالي 150 من الخلايا العصبية التي تحتوي على النموذج الجزيئي الساعات هذه دائرة للتحكم في سلوك الكبار الإيقاعية الذباب5. كثير أبسط لم تعمل بكامل طاقتها الإيقاعية دارة تتكون من 3 مجموعات من الخلايا العصبية على مدار الساعة-5 البطني الجانبي الخلايا العصبية (اللازم؛ 4 PDF-الإيجابي اللازم وواحد سالب PDF لنف، انظر أدناه)، 1s العصبية الظهرية 2 (DN1s) و 2s العصبية الظهرية 2 (DN2s)-موجود في اليرقات الدماغ6،7.
الدائرة الإيقاعية اليرقات بسيط يوفر نموذجا ممتازا لدراسة التفاعلات بين الاتصالات بين الخلايا العصبية والبرتقالة الجزيئية. استخدام مراسلنا الفلورسنت المطورة حديثا في–TDT، الذي يحاكي المستويات كل البروتين وموقعها سوبسيلولار، وسعينا إلى وصف ديناميات الجزيئية البرتقالة في مجموعات مختلفة على مدار الساعة العصبية فرعية في الدائرة الإيقاعية اليرقات 8. وعلاوة على ذلك، مع العلم بالدور الرئيسي لمعامل تفريق الصباغ neuropeptide (PDF) التي تنتجها اللازم 4 في تنظيم إيقاعات circadian في ال10،الخلايا العصبية المستوى9،11، أردنا النظر المباشر أثر PDF على الساعات الجزيئية. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة لرصد الجينات الإيقاعية إيقاعات في الدماغ اليرقات explant على مدى عدة أيام من الوقت الفاصل بين الفحص المجهري [كنفوكل]. وكان أيضا تكييف البروتوكول لفحوصات الدوائية لاختبار تأثير PDF أو غيرها من المركبات على المستوى في–TDT. وهكذا، وتكييف يتألف من إتاحة ثقافة explant الدماغ لتطبيق المخدرات وزيادة دقة الزمانية والتصوير لمدة أقصر.
السابقين فيفو ثقافة العقول المورفولوجية لمراحل تنموية مختلفة قد حددت سابقا12،13،،من1415،16،17 ،18. بينما استخدمت هذه البروتوكولات لتصوير مختلف الظواهر البيولوجية، البعض منهم غير متوافقة مع التصوير في القرار خلية واحدة أو لا تدعم الثقافة لأكثر من عدة ساعات. تشمل أساليب بديلة لإجراء تصوير حية طويلة الأجل من الخلايا العصبية الإيقاعية في المورفولوجية تصوير الإضاءة الحيوية الجزيئية إيقاعات19،،من2021 وتصوير الأسفار مؤشر الكالسيوم مع الورقة الخفيفة الميكروسكوب22،23. على الرغم من أن التصوير بالإضاءة الحيوية يمكن تحقيق أعلى الأزمنة والفحص المجهري الورقة الخفيفة يمكن أن تكون قابلة للتكيف للتصوير في فيفو ، أنها تقتصر على القرار المكانية وتتطلب أنظمة المجهر المتخصصة.
لتلائم الطريقة الموصوفة هنا هو تصور إشارات مضيئة في ثقافة الجامعة الدماغ في القرار خلية واحدة على مدى عدة أيام. هذه طريقة سهلة ومرنة يمكن تكييفها وفقا للصورة مثقف الكبار يطير العقول والتجارب الدوائية لدراسة العديد من مشاكل مختلفة في بيولوجيا الأعصاب المورفولوجية .
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفت لنا طريقة طويلة الأجل مجهرية الوقت الفاصل بين الأسفار من العقول اليرقات المستزرعة. يتوقف نجاح هذا النوع من التجارب على عدة عوامل، مثل صحة الثقافة، وطريقة لتجميد explant الدماغ، وكثافة الأسفار ونسبة الإشارة إلى الضوضاء مراسل، الزماني والمكاني القرار، و الوصول إلى explant. وهذه العوامل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر روسباش مايكل له الإرشاد والدعم خلال المرحلة الأولى من تطوير هذا الأسلوب. تم تمويل هذا العمل من قبل JST المعزوفة البرنامج، مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_149893 و 31003A_169548)، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC-الجنيه الاسترليني-311194)، ومؤسسة نوفارتيس “البحوث” الطبية البيولوجية الطبية (13A39) وجامعة جنيف .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?. Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 – Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila’s circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O’Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
