Микроинъекции эмбриона и трансплантации техника для манипуляции генома Nasonia vitripennis

1. N. Vitripennis колонии воспитания Настройка несколько колоний (~ 3-5), поместив 200-500 н. vitripennis взрослых (при соотношении 3:1 женщины: мужчины) в клетках общежитии ошибка.Примечание: Альтернативой использованию ошибка общежития, осы также могут распространяться в нескольких, небольшие стеклянные пробирки, подключены с хлопка с примерно 15-20 ОС/флакон. Поддерживать осы 25 ± 1 ° C с относительной влажности 30% и 12:12 света темные цикл, кормит их ежедневно с маленькие капельки 1:10 (v/v) сахарозы/водный раствор.Примечание: Распространение осы колоний и коллекции могут также проводиться при комнатной температуре без контролируемой влажности; Однако температура ниже 25 ° C будет немного ниже сроков развития эмбрионов. Разрешить осы mate для по крайней мере за 4 дня до инъекции. За первые два дня, позволяют растяжением женщин кормить на свежий S. пузырчатая куколки, а также маленькие капельки 1:10 (v/v) сахарозы/водный раствор. Для следующих двух дней удалите blowfly куколки лишить женщин осы сайта откладки яиц, что делает их очень беременных. 2. сбор и выравнивание N. Vitripennis этап предварительной бластодермы эмбрионов Разрешить женского осы для паразитируют (разведению эмбрионов) в молодых хостов (S. пузырчатая куколки). Чтобы сохранить свежий хостов, хранить хостов в 4 ° C сразу же после их получения и удалить только при необходимости.Примечание: Молодые хостов может быть определен путем иметь красный цветной puparium, тогда как старые хозяева имеют темный цветной puparium (рис. 1A). Место индивидуальных свежие S. пузырчатая куколки в пробку пены с отверстием куколок размера вырезать в центр. Предоставляют только ~ 0,2 см переднего конца (предпочтительный откладка сайт) узла для максимальной концентрации parasitization и легче эмбриона коллекции.Примечание: Округлены в передний конец, в то время как задний конец, толще и содержит «кратер как» открытие (рис. 1B). Место пребывания куколки (примерно 5 принимающих куколки за 100 ОС) в этой договоренности в клетку и ждать примерно 45 минут, чтобы позволить осы паразитируют их (рис. 2- ii).Примечание: Это очень важно, что эмбрионы молодых, насколько это возможно, в идеале в течение первого часа oviposited, чтобы обеспечить, что они находятся в стадии предварительного бластодермы. Старый эмбрионов (> 1,5 ч) не должен быть введен. Удаление количеству хостов, получая их от руки и осторожно чистки/продувания любого проживающего осы. Заменить их свежие узлы после каждого ~ 15 мин продолжать собирать рано поставил яйца во время инъекции. Вручную удалите свежезаваренным количеству хостов из клетки. Под микроскопом рассечения, используя пинцет тщательно очистите от заднего конца (0,4 см) наружных puparium (куколки оболочки) подвергать N. vitripennis яйца (рис. 2- iii).Примечание: Необходимо быть осторожность во избежание проколов кожи куколки; Если это произойдет, гемолимфа смачивают осы эмбрионов, которые будет очень трудно удалить микроинъекции. Используйте жидкий клей клей coverslip на слайд чистого стекла подготовить слайд выравнивание эмбриона (рис. 3).Примечание: Высокая производительность Мгновенный клей используется для повышения адгезии и сушки скорость, однако любой клей, который может держать coverslip передвигаться на слайд является приемлемым. Автомобиль эмбрионы от хоста тщательно с мокрой кистью штраф наконечник, убедившись в том, чтобы не повредить мягкие куколки кожу хозяина.Примечание: ‘ выбрать эмбрион,’ который является по существу половина пары ультрадисперсных щипцов, может использоваться вместо кисти. Трансфер ~ 20 эмбрионов один на один на слайд, непосредственно примыкающем к стороне coverslip с мокрой кистью. Ориент переднего конца эмбриона против слайд крышка края так, чтобы задний конец эмбрионы указал в том же направлении (Рисунок 2- iv). Это позволит обеспечить высокую точность путем инъекций в ту же позицию среди всех эмбрионов.Примечание: Этот метод более не требуют двухсторонняя клейкая лента для исправить эмбрионов на слайд, как описано ранее21,22. Кроме того не забираются эмбриона, или крышки яйца с маслом галоидоуглеводородов во время инъекции, как описано выше для N. vitripennis эмбриона микроинъекции22. 3. Подготовка иглы для микроинъекций Поместите алюмосиликатного стекла капилляров в съемник иглы.Примечание: Хороший игла имеет решающее значение для успешного N. vitripennis эмбрионы инъекции. Инъекционным иглам должен иметь острые и штраф наконечник позволяет легко проникновения через хориона. Кварц и боросиликатного капиллярного иглы также может быть использован (рис. 4). Установите тепла до 605, скорость до 130, задержки до 80, тянуть до 70 и давление до 500 на иглы съемник.Примечание: Дополнительные иглы съемник настройки для буксировки кварца и боросиликатного иглы можно увидеть в таблице 1; параметры могут различаться для разных Съемники и нитей. Активируйте иглы съемник для создания правильного иглы. При необходимости повторите для производства несколько игл.Примечание: Вытащил иглы могут храниться, помещая их в чашке Петри, содержащий несколько параллельных рулоны коммерческих моделей глины. Скос кончик иглы, слегка касаясь кончика к пластине абразивные алмазные около 10 s при 25 ° C (рис. 2- iii).Примечание: Инъекционным иглам выгоду от фаски путем поощрения вступления в эмбрионов с минимальным ущербом при одновременно увеличения потока регенты через иглу. 4. эмбриона микроинъекции Подготовить раствор для инъекций смесь, состоящую из генома модификации реагенты (например, transposon + вспомогательный Транспозаза, или CRIPSR реагенты, и т.д.) и держать его на льду. Загрузите иглу с 2 мкл инъекции смеси с помощью microloader советы.Примечание: Смеси инъекции, продемонстрировал в протоколе состоит из одного руководство РНК (sgRNA) (s) и Рекомбинантный белок Cas9, смешанные в H2O. Место стекла слайд с подкладом эмбрионы на стадии составной микроскоп. Осторожно вставьте иглу в задний конец эмбриона с вертикальный угол 25-35 °.Придать пл 1-5 инъекций смеси (около 2-10% от объема эмбриона) и убедитесь, что эмбрион, как представляется, слегка набухает как смесь вводят в него (рис. 2- iv).Примечание: Если смесь слишком много инъекции вводят в эмбриона он может лопнуть, развенчание цитоплазмы из эмбриона. Кроме того, неправильно скошенный или сломанные иглы с слишком большой открытия также может вызвать разрыв эмбриона. Попробуйте повторно фаски иглы в случае засорения. В цитоплазму н. vitripennis эмбрионы необычно вязкой и липкое, что приводит к частым иглы, засорения (1/25 инъекции).Примечание: Важно сохранить эмбрионы влажный период впрыска, регулярно добавив деионизированной водой с помощью кисти. Количество воды на кисть является ключом для перемещения эмбрионов и выровнять с легкостью. Слишком много воды приводит к эмбрионов, которые плавающей и слишком мало воды делает их трудно передвигаться. Придать ~ 20-40 яйца в то время (занимает примерно 10 минут), затем остановить. Передача вводят яйца с мокрой кистью, слегка касаясь вводят яйца и поместите их в узел. Затем продолжить инъекций, снова используя свежие недавно заложили партии яиц (> 1 час старый).Примечание: Идеально этот протокол является наиболее эффективным если один человек постоянно сбора и выстраиваются яйца, а другому лицу инъекций компоненты модификации генома и пересадка вводят эмбрионов для хоста куколок. 5. пересадка эмбрионов N. vitripennis на Pre-stung принимающей Injected G0 Осторожно поместите вводят G0 эмбрионов на ранее задело S. пузырчатая куколки (Рисунок 2- vi) с мокрой кистью после микроинъекции.Примечание: Хост куколок, используемые для сбора эмбрионов для микроинъекции будет работать для этой цели. Кроме того несмотря на значительные усилия, в настоящее время нет доступных искусственные диеты, которая может быть использоваться22. Место до 40 эмбрионы вводят один на один раз на один узел предварительно задело чтобы избежать переполненности и личинок конкуренции.Примечание: Инъекции может привести к повреждению эмбрионов; небрежно трансплантация вводят эмбрионов для куколок хост может сжать вводят компонента или желток и привести к смерти эмбрионов. Место пребывания куколки в чашку Петри с влажной фильтровальная бумага и ватные шарики и инкубировать их при 25 ° C с примерно 70% влажности, пока эмбрионы вводят Люк (примерно 1-2 дня) (Рисунок 2- vii).Примечание: Важно отметить, что хосты могут быть оставлены с очищенные от puparium и н. vitripennis яйца будут нормально развиваться до тех пор, пока они инкубируют в камере увлажненные (Петри блюдо с влажной фильтровальная бумага и ватные шарики) для предотвращения высыхания. Инкубации при комнатной температуре и влажности от смоченной ватные шарики достаточно, в случае, если влажность не может контролироваться. Передача принимающей куколки в новой Петри на 25°C и влажности воздуха 70% после G0 эмбрионов люк. Мониторинг хост куколок и вводят личинки0 G ежедневно. Если хост куколок имеют неприятный запах, передавать новые куколки здорового пребывания вводят личинки. 6. Скрининг для изменения генома Удаление каждого N. vitripennis куколки от узла, с помощью тонкой кисточки или эмбриона забрать. Вводят личинки0 G должен окукливаются инъекции пост около 8 дней. Место каждого удалены куколки в изолированной стеклянный флакон подключен с хлопком и позволить им выйти как взрослые0 G, обеспечивая что вылупившиеся женщин будет девственной который поможет с течению генетических кресты.Примечание: Самки могут быть отсортированы от мужчины, Длина крыла: женщины имеют больше крылья, которые удлиняют мимо корпус профиль при включении на стороне. Все microinjected женские куколки могут быть помещены вместе, во флаконе подключен, и то же самое относится к мужской куколок. Экран G0 лиц, после eclosion, либо ПЦР или визуально (если нарушая фенотипические гена). Например, если ТРИФОСФАТЫ используется для создания исключений данного гена и нарушается ген дает видимый фенотип, затем отсортировать и держать людей с черепашки версии затронутых фенотип (Рисунок 2- viii)21. Если, однако, пострадавших ген кодирует для неотображаемых фенотип, таких как мутант важно генов, выполните пересечение схемы (крест G0 мужчины с женщиной дикого типа, или женщина с дикого типа мужчины крест0 G) для восстановления и экран для наследственные мутантов через опробование летальности или бесплодия.Примечание: Похож на D. melanogaster, н. vitripennis взрослых может быть иммобилизованным под воздействием CO2 позволяет для простой манипуляции. Кроме того unmated женщин приведет к 100% гаплоидным мужской выводка, поэтому женщина мутантов unmated может привести к большое количество мутант мужчин, которые могут использоваться для последующего анализа.Примечание: Мутации в важно генов нужно будет храниться спаривания сохранившихся G0 вводили женщин (предположительно гетерозиготных мутации) и дикого типа мужчин; в данном конкретном случае половина мужского потомства1 G должен умереть из-за наследования смертоносных мутации, в то время как половина потомства женщин1 G будет носителей смертоносной. Подмес G0 взрослых и экран G1 потомства для вставки трансген, используя маркеры трансгенез, если целью является трансгенез. В настоящее время трансгенез остается будет продемонстрирована в н. vitripennis.