胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

1. N. Vitripennisコロニー飼育 いくつかの植民地を設定 (~ 3-5) バグ寮ケージで 200-500名 vitripennis大人 (女性: 男性の比率は 3:1) を配置することによって。注: バグ寮、ハチを使用する代わりには、約 15-20 ハチ/バイアルと綿と差し込まれる複数の小さなガラスの試験管にも反映できます。 25 ± 1:10 (v/v) の小さな液滴と毎日を餌付け 1 ° C 相対湿度 30% と 12:12 ライト暗い周期のスズメバチを維持/スクロース水溶液。注: 制御湿度; しなくても室温でハチのコロニーおよびコレクションの伝搬を実施もできます。ただし、温度は 25 ° C、胚の発育のタイミングを少し下げるよりも低い。 注射前に、少なくとも 4 日間チームメイトにハチを許可します。 最初の 2 日間、新鮮な餌に雌成虫の交尾を許可する小さな水滴、1:10 (v/v) と同様に米 bullataの蛹、スクロース/水溶液。 次の 2 日間、非常に妊娠し、産卵サイトの女性のハチを奪うにハエの蛹を削除します。 2 収集・ n. Vitripennis前胚胚の配置 寄生しているハチを女性を許可する (胚プレハブハウス) 若いホスト (S. bullata蛹)。ホストを新鮮に保つには、すぐにそれらを取得した後、4 ° C でホストを格納、必要な場合のみ削除します。注: 古い計算機がある暗い色の蛹殻 (図 1 a) に対し、赤い色の蛹殻を持っていることによって若いホストを決定できます。 個々 の新鮮な米 bullataを配置蛹サイズの孔を有する発泡ストッパーに蛹を中心にカットします。のみを公開 〜 寄生状況と簡単に胚のコレクションの最大濃度のホストの前方終わり (最寄りの産卵部位) の 0.2 cm。注: 後端が厚く、クレーターのような開口部 (図 1 b) が含まれている間、前方は丸められます。 ケージにこの配置でホスト蛹 (100 ハチあたり大体 5 蛹ホスト)、約 45 分 (図 2- ii) それらに寄生するハチを許可するを待ちます。注: それは胚内にあること、できるだけ若いと理想的な前胚の段階であることを確認、頭中の最初の 1 時間は非常に重要です。古い胚 (> 1.5 h) 注入いないする必要があります。 手で、優しくブラッシング/吹居住アシナガバチそれらを取得することによって寄生ホストを削除します。後新鮮なホストに置き換えてすべて 〜 15 分早く注射の中に卵をステージング収集を続けます。 手でケージから新鮮な寄生のホストを削除します。(名) vitripennis卵 (図 2- iii) を公開する外装囲蛹 (さなぎシェル) の後端 (0.4 cm) 離れて鉗子を使用して解剖顕微鏡の下で慎重に皮します。注: する必要があります注意蛹皮膚を刺さないようにこの場合、体液はマイクロインジェクションを削除する非常に困難になりますハチの胚を湿らせます。 胚配置スライド (図 3) を準備するのにきれいなガラスのスライドに coverslip を接着するのに液体接着剤を使用します。注: 高性能瞬間接着剤の接着強さの向上に使用し、乾燥スピード、しかし、coverslip のスライドの移動を防ぐことができる任意の接着剤は許容されます。 払落しウェット ファイン ・ チップ絵筆で慎重にホストの柔らかい蛹肌を傷つけないようにホストから胚。注: ‘ 胚を選んで、「絵筆の代わりに使用できる超微細鉗子のペアの半分本質的にであります。 転送 〜 20 胚 1 つをスライド、ウェットの絵筆でカバーガラスの側に隣接。胚の後部の端が同じ方向 (図 2- 4) で指摘したように、カバー スライドのエッジに対して胚の前方の端に合わせます。これは高精度のすべての胚の間で同じ位置に注入することのなります。注: この改善方法は、スライド21,22を前述のように胚を修正するための両面粘着テープを必要ありません。さらに、胚を脱水しないまたはN. vitripennis胚マイクロインジェクション22は前述のように射出時ハロカーボン油で卵を覆います。 3 薬剤の針の準備 針の引き手にアルミノケイ酸塩毛細管ガラスを配置します。注: 良い針が成功; vitripennisの重要な胚注射。注射針は、シャープとファイン ・ チップ絨毛膜を介して簡単に侵入する必要があります。また毛細血管は石英、ホウケイ酸針をすることができます (図 4) を使用します。 針の引き手の 70、および 500 に圧力に 605 に熱、速度130、80 に遅延、プルを設定します。注: 追加針引き手設定石英、ホウケイ酸針を引っ張るためのテーブル 1を見ることができます。パラメーターは、別の引き手とフィラメントのため異なる場合があります。 正しい針を作成する針の引き手をアクティブにします。複数針の生産に必要なを繰り返します。注: いくつかの平行巻商業モデラーの粘土を含んでいるペトリ皿にそれらを配置することによって引っ張られた針を格納できます。 少しダイヤモンド研磨プレート約 10 に先端を触れることにより、針の先端の面取り 25 ° C (図 2- iii) で s。注: 注射針の針を介して同時に摂政の流れを高めながら最小限のダメージで胚への参入を促進することにより面取り恩恵します。 4. 胚マイクロインジェクション (例えばトランスポゾン + ヘルパー トランスポザーゼまたは CRIPSR 試薬等)、ゲノム修飾試薬から成る注入混合物を準備し、氷の上にそれを維持します。 2 μ L 注入混合物のと注射針をロードするには、microloader のヒントを使用します。注: プロトコルに示す注入混合物から成ってシングル ガイド RNA (sgRNA) (s) と組換え Cas9 蛋白質混合 H2o. 複合顕微鏡のステージ上に並んでの胚をガラス スライドを配置します。 注意深く鉛直角の 25 から 35 ° で胚の後部の端に針を挿入します。注入混合物 (胎児のボリュームの約 2-10%) の 1-5 pL を挿入して胎児が少し膨らむように混合物が注入される (図 2- iv) に表示されていることを確認します。注: あまり注入混合物は胚に注入される場合それは、解消する胚から細胞質をバーストがあります。さらに、不適切なベベルまたは針が大きすぎて壊れて開口部は、胚の破壊を引き起こす可能性があります。 目詰まりが発生した場合は、針の再面取りをしてみてください。(名) vitripennis胚の細胞質が異常に粘性、粘着性がある、頻繁に針の目詰まり (1/25 注射) に 。注: 定期的に絵筆を使用して脱イオン水を追加して注入期間中に胚を湿った保つこと重要です。ブラシの水の量は、胚を移動し、使いやすさに合わせて鍵です。あまりにも多くの水結果胚浮動と少なすぎる水はそれらを移動にくくなります。 注入 ~ 時 (約 10 分を取る必要があります)、20-40 個の卵を停止します。注入された卵に軽く触れることによってぬれた絵筆で注入された卵を転送し、ホストにそれらを置きます。卵のバッチを置いた新しく新鮮なを使用して再度注入を続行 (> 1 h 古い)。注: 理想的にはこのプロトコルは、最も効果的な一人は継続的に収集し、卵を並べる場合は、別の人はゲノム修飾成分を注入することでホスト蛹に注入された胚を移植します。 5. 注入G0を Pre-stung ホスト名 vitripennis胚の移植 以前刺されたS. bullataに挿入された G0胚を慎重に配置マイクロインジェクション後ウェット絵筆で蛹 (図 2- 6)。注: マイクロインジェクションの胚を収集するために使用されるホスト蛹はこの目的のために動作します.また、多大な努力にもかかわらず現在ありません使用22をすることができます利用の人工飼料。 人口過密や幼虫の競争を避けるために事前に刺された単一のホストに同時に最大 40 注入された胚を 1 つを配置します。注: インジェクションが発生; 胚に損傷不注意なホスト蛹に注入された胚移植可能性があります挿入されたコンポーネントまたは、卵黄を絞るし、胚の死に 。 湿ったフィルター ペーパーとコットン ボール、ペトリ皿にホスト蛹を置き、注入された胚孵化 (約 1-2 日) まで湿度 70% 約 25 ° C でそれらを孵化させなさい (図 2- vii)。注: 重要なは、ホストをおくことも可能で、皮をむいた蛹殻からN. vitripennis卵正常に成長するので乾燥を防ぐため加湿チャンバー (湿ったフィルター ペーパーと脱脂綿を敷いたペトリ皿) で孵化させます。湿度を制御することはできない場合湿らせたコットン ボールから湿度と室温でインキュベートで十分です。 G0胚孵化後、湿度 70%、25°C で新しいペトリ皿にホスト蛹を転送します。 ホスト蛹と注入された G0幼虫を毎日監視します。ホスト蛹が悪臭を有すれば、新しい健康的なホスト蛹に注入された幼虫を転送します。 6 ゲノムの変更のためのスクリーニング 細かいペイント ブラシまたは胚選択のいずれかを使用してホストから各N. vitripennis蛹を削除します。注入された G0幼虫は、注射後約 8 日を蛹する必要があります。 場所各削除孤立したバイアルさなぎは綿と差し込まれ、G0大人、孵化した女性が処女ことの確保として浮上することができますは、下流遺伝子交雑しやすくなります。注: 女性並べ替えることができます男性から翅長: 女性が体のプロフィールをオン側に過去を拡張する長い翼を持っています。接続のバイアルにすべて microinjected 雌蛹を一緒に置くことが、同じオスの蛹に適用します。 羽化、または視覚的にいずれかの PCR による後の画面 G0個人 (場合、表現型の遺伝子を中断)。たとえば、CRISPR を使用して特定の遺伝子の削除を作成し、破壊された遺伝子を付与する目に見える表現型、並べ替えて、影響を受ける表現型 (図 2- viii) の突然変異体のバージョンを持つ個人を維持21。場合、ただし、影響を受けた遺伝子が重要な遺伝子の変異など、非可視表現型のエンコードを回復し画面の交差方式 (クロス G0野生型女性と男性またはクロス G0野生型男性と女性) を実行します。致死または不妊の試金による遺伝的変異体。注:キイロショウジョウバエ、 N. vitripennis大人のようを簡単な操作を可能にする CO2の露出によって固定することができます。また、つがいでない雌に上昇を与える 100% 半数の男性ひな、したがって変異つがいでない雌はその後の分析のため使用することができます変異体の男性の数が多いに上昇を与えることができます。注: 重要な遺伝子の突然変異が存続 G0注入雌の (推定上突然変異のヘテロ接合体) 野生型雄; の交配によって保たれる必要があります。G1女性子孫の半分は、致死性のキャリアがこの特定のケースで G1の男性の子孫の半分は致死突然変異の遺伝のため死ぬべきです。 Outcross G0大人と目標が遺伝子の場合、遺伝子マーカーを用いた遺伝子挿入画面 G1子孫。現在遺伝子であるN. vitripennisままになります。