Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

1. N. Vitripennis colonie d’élevage Mis en place plusieurs colonies (~ 3-5) en plaçant le 200-500 N. vitripennis adultes (avec un ratio de 3:1 de femelle : mâle) dans des cages de dortoir de bogue.NOTE : Plutôt que d’utiliser les dortoirs de bogue, guêpes peut également être multiplié multiples, petit verre éprouvettes bouchées avec du coton avec environ 15-20 guêpes/flacon. Maintenir les guêpes à 25 ± 1 ° C avec une humidité relative de 30 % et un cycle de lumière sombre 12:12, leur alimentation quotidienne avec des petites gouttelettes de 01:10 (v/v) solution de saccharose/eau.NOTE : Propagation des collections et des colonies de guêpes peut également être mise à température ambiante sans humidité contrôlée ; Cependant, les températures inférieures à 25 ° C fera baisser un peu le moment du développement des embryons. Permettre aux guêpes s’accoupler pendant au moins 4 jours avant les injections. Pour les deux premiers jours, permettent des femelles accouplées pour se nourrir sur la nouvelle S. bullata nymphes, mais aussi de petites gouttelettes d’un 01:10 (v/v) solution de saccharose/eau. Pour les deux jours suivants, retirez la pupe de mouche à viande pour priver les guêpes femelles d’un site de Ponte, ce qui les rend très gravides. 2. collecte et alignement des embryons au stade de pré blastoderme N. Vitripennis Permettre les guêpes femelles à parasiter (pondent leurs oeufs des embryons) dans les jeunes hôtes (nymphesS. bullata ). Pour conserver la fraîcheur des hôtes, stocker des hôtes à 4 ° C immédiatement après leur obtention et retirer seulement lorsque nécessaire.NOTE : Les jeunes hôtes peuvent être déterminés en ayant un puparium coloré rouge alors que les hôtes âgés possèdent un puparium de couleur plus foncée (Figure 1 a). Placer les frais individuels S. bullata pupes dans un bouchon de mousse avec un trou de la grosseur nymphes couper au centre. Exposer seulement ~ 0,2 cm de l’extrémité antérieure (site de Ponte privilégié) de l’hôte pour la concentration maximale de parasitisme et la collecte des embryons plus facile.Remarque : L’extrémité antérieure est arrondie, tandis que l’extrémité postérieure est plus épaisse et contient une ouverture « cratère-like » (Figure 1 b). Placez les nymphes de l’hôte (à peu près 5 nymphes hôte par 100 guêpes) dans cet arrangement dans la cage et attendre environ 45 min pour permettre les guêpes parasitent les eux (Figure 2- ii).Remarque : Il est très important que les embryons sont aussi jeunes que possible, idéalement au sein de la première heure d’être pondus, pour s’assurer qu’ils sont dans la phase pré blastoderme. Vieux embryons (> 1,5 h) ne doit pas être injecté. Supprimer des hôtes parasités en les extrayant manuellement et délicatement brossage/soufflant tout résidant de guêpes. Remplacez-les par des hôtes frais après chaque ~ 15 min pour continuer à recueillir dès le début mis en scène oeufs lors des injections. Retirez les hôtes parasités fraîchement de cage à la main. Sous un microscope à dissection, à l’aide de forceps, soigneusement Décollez l’extrémité postérieure (0,4 cm) de l’extérieur puparium (coquille pupal) pour exposer les oeufs N. vitripennis (Figure 2- iii).Remarque : Il faut pour éviter de percer la peau pupe ; dans ce cas, l’hémolymphe s’humidifiera les embryons de la guêpe, qui seront très difficiles à enlever pour le microinjection. Utiliser l’adhésif liquide pour coller une lamelle sur une lame de verre propre pour préparer une diapositive d’alignement embryon (Figure 3).Remarque : Un adhésif instantané haute performance est utilisé pour augmenter l’adhérence et vitesse de séchage, cependant n’importe quelle colle qui peut garder la lamelle de se déplacer sur la diapositive est acceptable. Bercé les embryons de l’hôte soigneusement avec un pinceau humide de fine pointe, faisant attention à ne pas endommager la peau molle de pupe de l’hôte.NOTE : un “embryon pick,” qui est essentiellement une moitié d’une paire de pinces ultrafines, peut être utilisé au lieu d’un pinceau. Transfert ~ 20 embryons un par un sur le toboggan, juste à côté du côté de la lamelle avec un pinceau humide. Orientez l’extrémité antérieure de l’embryon contre le bord de la diapositive de la couverture de sorte que l’extrémité postérieure des embryons est pointée dans la même direction (Figure 2- iv). Ceci permettra une plus grande précision d’injection dans la même position parmi tous les embryons.NOTE : Cette technique améliorée ne nécessite pas de bande adhésive double-face pour fixer les embryons à la diapositive comme décrit plus haut21,22. En outre, ne pas dessécher les embryons, ou couvrir les œufs avec Huilehalocarbone pendant l’injection comme décrit plus haut pour N. vitripennis embryon microinjection22. 3. aiguille préparatifs Microinjections Placez un verre capillaire aluminosilicate dans un extracteur à aiguille.Remarque : Une aiguille est critique pour le succès N. vitripennis injections d’embryons. Les aiguilles d’injection devraient avoir un sharp et pointe fine pour permettre une pénétration facile à travers le chorion. Quartz et borosilicate aiguilles capillaires peuvent également être utilisés (Figure 4). Régler la chaleur à 605, la Vitesse à 130, le retard à 80, le tirer à 70 et la pression à 500 sur un extracteur d’aiguille.NOTE : Paramètres extracteur aiguille supplémentaire pour tirer les quartz et aiguilles de Borosilicate peuvent être vu dans le tableau 1; les paramètres peuvent varier pour les filaments et différents extracteurs. Activer l’extracteur d’aiguille pour créer l’aiguille correct. Répéter au besoin pour la production de plusieurs aiguilles.Remarque : Tiré d’aiguilles peuvent être stockés en les plaçant dans une boîte de Pétri contenant que parallèlement plusieurs rouleaux d’argile commercial modeler. La pointe de l’aiguille du biseau en touchant légèrement l’extrémité de la plaque abrasifs diamant autour de 10 s à 25 ° C (Figure 2- iii).NOTE : Les aiguilles à injection bénéficient de biseautage en favorisant l’entrée dans les embryons avec un minimum de dommages tout en améliorant le débit des régents à travers l’aiguille. 4. embryon Microinjection Préparer le mélange d’injection composé de réactifs de modification du génome (p. ex., transposon + helper transposase, ou réactifs CRIPSR, etc.) et gardez-le sur la glace. Charger l’aiguille d’injection avec 2 µL du mélange de l’injection à l’aide de conseils de microloader.Remarque : L’injection de mélange a démontré dans le protocole se compose de single-guide de l’ARN (sgRNA) (s) et la protéine recombinante Cas9 mélangés dans H2O. Placer la lame de verre avec les embryons doublées sur la scène d’un microscope composé. Insérer l’aiguille dans l’extrémité postérieure de l’embryon avec un angle vertical de 25-35 °.Injecter 1-5 pL de l’injection de mélange (environ 2 à 10 % du volume de l’embryon) et faire en sorte que l’embryon semble légèrement gonfler car le mélange est injecté dedans (Figure 2- iv).Remarque : Si trop d’injection de mélange est injectée dans l’embryon, elle peut éclater dissiper le cytoplasme de l’embryon. En outre, mal biseauté ou cassé les aiguilles avec trop grande d’une ouverture peut aussi causer la rupture de l’embryon. Essayez de re-taillante aiguilles en cas de colmatage. Le cytoplasme des embryons N. vitripennis est exceptionnellement visqueuse et collante, qui conduit à aiguille fréquente colmatage (injections de 1/25).Remarque : Il est important de garder les embryons humide pendant la période d’injection en ajoutant régulièrement de l’eau déminéralisée en utilisant le pinceau. La quantité d’eau sur le pinceau est la clé pour se déplacer les embryons et aligner en toute simplicité. Trop d’eau entraîne chez les embryons flottant et trop peu d’eau qui les rend difficiles à déplacer. Injecter des ~ 20 et 40 œufs à la fois (devrait prendre environ 10 min), puis s’arrête. Transférer les oeufs injectés avec un pinceau humide en touchant légèrement les œufs injectés et placez-les dans un hôte. Puis continuer par injection à l’aide une nouvelle nouvellement posées lot d’oeufs (> âgées de 1 h).NOTE : Idéalement ce protocole est plus efficace si une personne est en permanence collecte et alignant les oeufs, alors qu’une autre personne est injecter les éléments de modification du génome et transplanter des embryons injectées aux nymphes de l’hôte. 5. transplantation Injected G0 N. vitripennis embryons sur Pre-stung hôte Placer soigneusement les embryons de0 G injectés sur un déjà piqué S. bullata pupes (Figure 2- vi) avec un pinceau humide après microinjection.NOTE : Les pupes d’hôte utilisés pour collecter des embryons de microinjection vont travailler à cette fin. En outre, malgré des efforts considérables, il n’y a actuellement aucune alimentation artificielle disponible qui peut être utilisé22. Placez jusqu’à 40 embryons injectés un à la fois sur un seul hôte préalablement piqué d’éviter la concurrence de surpeuplement et larve.NOTE : Injection peut endommager les embryons ; imprudente transplantation d’embryons injectés pour les pupes hôte peut presser le composant injecté ou le jaune sur et entraîner la mort des embryons. Les pupes d’hôte dans une boîte de Pétri avec papier filtre humide et boules de coton et les incuber à 25 ° C, avec environ 70 % d’humidité jusqu’à éclosent des embryons injectées (environ 1 à 2 jours) (Figure 2- vii).NOTE : Ce qui est important, hôtes peuvent être laissés avec un Pelé puparium et le N. vitripennis oeufs développera normalement tant qu’ils sont incubés dans une chambre humidifiée (boîte de Pétri avec papier filtre humide et boules de coton) pour éviter la dessiccation. Incubation à température ambiante et avec une humidité de l’ouate humidifiée suffit au cas où l’humidité ne peut pas être contrôlée. Transférer les pupes d’hôte dans une nouvelle boîte de Pétri à 70 % d’humidité et de 25°C après l’éclosion de G0 embryons. Surveiller hôte nymphes et larves de0 G injectés tous les jours. Si les pupes d’hôte ont une odeur fétide, transférer les larves injectés à nouveau nymphes hôte sain. 6. dépistage des Modifications du génome Retirez chaque N. vitripennis nymphes de l’hôte à l’aide d’un pinceau fin ou un embryon pick. Les larves de0 G injectés devraient se transforment en pupes environ 8 jours post injection. Placez chaque nymphe enlevée dans un flacon de verre isolé bouché avec du coton et leur permettre de devenir des adultes de0 G, veiller à ce que les femelles écloses seront vierges qui aidera avec des croisements génétiques en aval.Remarque : Les femelles peuvent être triées de mâles par la longueur de l’aile : les femelles ont des ailes plus longues qui s’étendent au-delà du profil de corps quand tourné sur le côté. Toutes les nymphes femelles microinjectés peuvent être assemblés dans un flacon bouché, et il en va de même pour les nymphes mâles. Les personnes de0 écran G, après l’éclosion, soit PCR ou visuellement (si perturbant un gène phénotypique). Par exemple, si CRISPR est utilisé pour créer des destructions dans un gène donné, et le gène perturbé confère un phénotype visible, puis trier et conserver les individus avec une version mutante du phénotype touchée (Figure 2- viii)21. Si, toutefois, le gène affecté codant pour un phénotype non visibles, comme une mutante d’un gène essentiel, effectuer un programme de croisement (Croix G0 mâle avec une femelle type sauvage ou croix G0 femelle mâle type sauvage) pour récupérer et d’écran pour mutants héréditaires par dosage de létalité ou la stérilité.NOTE : Semblable à d. melanogaster, N. vitripennis adultes peut être immobilisé par l’exposition au CO2 permettant une manipulation simple. En outre, les femelles accouplées donneront lieu à 100 % couvées mâles haploïdes, ainsi donc qu’une femelle non accouplée mutante peut donner lieu à grand nombre de mâles mutants qui peut être utilisé pour une analyse ultérieure.Remarque : Mutations dans les gènes essentiels devra être conservé par accouplement survivant G0 injecté femelles (vraisemblablement hétérozygotes pour une mutation) mâles type sauvage ; dans ce cas précis, la moitié de la descendance mâle de1 G devrait mourir à cause de l’héritage de la mutation létale, alors que la moitié de la progéniture femelle de1 G seront porteurs de la mortelle. Croiser les adultes0 G et descendance1 écran G transgène d’insertions à l’aide de marqueurs de transgénèse si l’objectif est la transgénèse. Actuellement, transgenèse reste à être démontrée chez N. vitripennis.