Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا
Summary
Microinjection الأجنة فيتريبينيس ناسونيا أسلوب أساسي لتوليد التعديلات الجينوم الموروثة. الموصوفة هنا هو إجراء مفصل ل microinjection وزرع الأجنة فيتريبينيس ناسونيا ، الذي سوف يسهل إلى حد كبير التلاعب الجينوم مستقبلا في هذا الحي.
Abstract
دبور جوهره فيتريبينيس ناسونيا نشأ كنظام نموذج فعال لدراسة العمليات بما في ذلك تحديد نوع الجنس وتحديد جنس هابلو مثنوية وتوليف السم والتفاعلات المضيف-سيمبيونت، من بين آخرين. قيداً رئيسيا للعمل مع هذا الكائن هو عدم وجود بروتوكولات فعالة لإجراء تعديلات الجينوم الموجهة. جزء هام من تعديل الجينوم هو التسليم لتحرير المواد الكاشفة، بما في ذلك جزيئات كريسبر/Cas9، إلى الأجنة عن طريق microinjection. بينما microinjection بشكل جيد في العديد من نموذج الكائنات، هذا الأسلوب يشكل تحديا كبيرا لأداء في فيتريبينيس أ أساسا بسبب حجم الجنين صغير به، وحقيقة أن التنمية الجنينية يحدث تماما داخل عذراء الذبابة الطفيل. الإجراء التالي يتغلب على هذه التحديات الكبيرة في حين تثبت إجراء مبسط والبصرية لفعالية إزالة الأجنة دبور من الطفيل الخوادر المضيف، ميكروينجيكتينج لهم، وزرع بعناية لهم بالعودة إلى البلد المضيف لمواصلة وإنجاز التنمية. وسيعزز هذا البروتوكول بشدة قدرة المجموعات البحثية لإجراء تعديلات متقدمة الجينوم في هذا الحي.
Introduction
دبور جوهره، أ. فيتريبينيس، هو واحد من الأنواع الأربعة داخل جنس ناسونيا التي يتم اكتوباراسيتويدس من الذباب مثل ساركوفاجا bullata1أكل اللحم. بسبب فترات سريعة الأجيال، تيسيرا لتربية في المختبر، ومجموعة من السمات البيولوجية الفريدة والهامة، فيتريبينيس أ تم تركيز لتطوير العديد من الأدوات التجريبية الموجودة في الكائنات النموذج التقليدي . على سبيل المثال، تتضمن بعض السمات البيولوجية الفريدة نظام استنساخ هابلو ضعفاني2وعلاقة مع الطفيليات الميكروبية والوراثية3،4سوبيرنوماري (ب) كروموسوم5،6 ،7. مجتمعة، وهذه تجعل فيتريبينيس أ. نظام تجريبي مهم لإجراء تجارب تهدف إلى توضيح الجوانب الجزيئية والخلوية لهذه العمليات، بالإضافة إلى الآخرين بما في ذلك إنتاج السم8، 9والجنس عزم10،11، والتطور والتنمية محور نمط تشكيل12،،من1314. وعلاوة على ذلك، مجموعة الأدوات الوراثية لدراسة بيولوجيا N. فيتريبينيس زاد زيادة كبيرة على مدى العقد الماضي أو حتى، مع تسلسل الجينوم عالية الدقة15، التعبير الجيني عدة دراسات16،،من1718، القدرة على تعطيل وظيفيا التعبير الجيني الاعتماد على تدخل الجيش الملكي النيبالي19،([رني])20, الذي معا قد تحسنت الصوبة وقدرات أداء عكس علم الوراثة في هذا الحي.
على الرغم من العديد من التطورات العلمية الهامة وأدوات العمل الموسع في هذا الحي، اعتبارا من المعارف الحالية مجموعة واحدة فقط قد بنجاح أداء ميكروينجيكشنز الجنينية لتوليد الجينوم الموروثة التعديلات21. وهذا يرجع أساسا إلى الصعوبات التي تكتنف العمل مع الأجنة من فيتريبينيس أ أنها هشة جداً وصغيرة، يجري ~2/3 حجم الأجنة melanogaster المورفولوجية ، يجعلها عموما من الصعب التعامل. بالإضافة إلى ذلك، إيداع فيتريبينيس أ الإناث بيضها في الذبابة قبل اكتوى الخوادر، الذي يحدث بأكملها embryogenesis، اليرقات، والتنمية الخوادر. ولذلك، لنجاح ميكروينجيكشنز، مرحلة ما قبل بلاستوديرم، الأجنة يجب كفاءة جمع من المضيف الخوادر، ميكروينجيكتيد بسرعة، وزرع فورا إلى مضيفيهم للتنمية. هذه الخطوات تتطلب الدقة والمهارة لتجنب إتلاف الأجنة ميكروينجيكتيد، أو المضيفين الخوادر، مما يجعل أسلوب الطعن في حالات استثنائية. على الرغم من، هناك بروتوكول قصيرة واحدة نشرت أكثر من عقد قبل أن تصف فيتريبينيس أ الجنين microinjection22. ومع ذلك، يتطلب هذا الإجراء أن يكون مبشور الأجنة المزروعة حديثا، ويستخدم الشريط مثبت تثبيتاً للبيض ل microinjection، ولا تشمل مظاهرة مرئية تقنية. ولذلك، الموصوفة هنا هو وضع بروتوكول المستكملة والمنقحة، بما في ذلك إجراء visual، يبين بالتفصيل على بروتوكول خطوة بخطوة محسنة فيتريبينيس أ. ميكروينجيكتيونس الأجنة التي يمكن اتباعها من قبل أي مختبر الأساسية لتوليد الجينوم الموروثة تعديلات في هذه الحشرة نموذجا هاما.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسلسل الجينوم فيتريبينيس أ الأخيرة قد أطلقت العنان ضرورة هامة للأدوات الجزيئية لتوصيف وظيفيا الجينات غير معروف داخل هذه الأنواع23. النظام كريسبر-Cas9، والعديد من الجينات تحرير أدوات أخرى، ثبت أن تكون مفيدة في التحقيق في وظائف الجينات لعدد من الكائنات الحية24. ومع ذلك، تتطلب هذه الأدوات تولد الطفرات الموروثة، أداء ميكروينجيكشنز الجنين. ولذلك، أظهرت هنا هي تقنية بصرية مفصلة تتضمن عددا من الابتكارات التي تسمح بكفاءة فيتريبينيس أ. ميكروينجيكشنز الجنين.
عموما، هذا الأسلوب مفصلة يوفر عددا من الابتكارات الهامة، فيما يتعلق ب الأساليب الحالية23، التي تسمح بكفاءة فيتريبينيس أ. ميكروينجيكشنز الجنين. على سبيل المثال، إنشاء أداة أوفيبوسيتيون (رغوة سداده) لتيسير جمع السريع للأجنة، وتستخدم لتقييد زرع تماما إلى نهاية الخلفي للمضيف (الشكل 1)، والذي يسهل إلى حد كبير جمع العديد من الأجنة داخل البيض فترة قصيرة من الزمن. أيضا تحسين تقنيات تربية مستعمرات دبور بإعداد كبيرة لجمع أكبر عدد من البيض وتعريفها. بالإضافة إلى ذلك، للتعجيل بمحاذاة الجنين، هو تطوير جهاز محاذاة جنين الذي يسمح للأجنة ليكون الانحياز بكفاءة وحقن دون الحاجة إلى استخدام الأشرطة اللاصقة على الوجهين لتأمين الأجنة في مكان (الشكل 3).
وعلاوة على ذلك، وجد أن حفظ الأجنة رطبة بالماء أثناء الحقن ولا ديسيككاتينج الأجنة أو تغطيتها بالنفط تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة. بالإضافة إلى ذلك، يتم اختبار العديد من أنواع الزجاج الشعرية ويتم تحديد معلمات لتشييد الإبر مثالية ل microinjection أ. فيتريبينيس (الجدول 1، الرقم 4). وعلاوة على ذلك، وضعت التالية microinjection، بقاء الجنين معدلات قادرون على زيادة كبيرة بسبب حضانة البيض المحقون في اكتوى قبل المضيفين في الدوائر العليا-الرطوبة (70 في المائة). تسمح هذه الابتكارات لإجراء microinjection أكثر تبسيطا والناجح فيتريبينيس أ.
يمكن جعل تعديلات طفيفة فيما يتعلق بأجهزة الحقن، وتربية إجراءات هذا البروتوكول، وفقا لتفضيلات المستخدم. بيد أن عددا من الخطوات الحاسمة سيكون أساسيا لنجاح توليد طفرات في فيتريبينيس أ.. على سبيل المثال، تعمل بسرعة حتى يتم حقن الأجنة > القديمة ح 1، وضمان أن الحقن بالإبر حادة بما يكفي للتقليل من الضرر الذي يلحق الجنين على حد سواء سيكون أساسيا. بينما هذا البروتوكول يجب أن تكون فعالة لتوليد الطفرات في جينات كثيرة (أن لم يكن كلها)، هو القيد الرئيسي واحد شرط كريبسر/Cas9 لاستهداف تسلسل “بام” (نج) التي ستحدد تسلسل الهدف.
وفي الختام، يمكن استخدام هذه التقنية المحسنة إنشاء أنواع عديدة من التعديلات الجينوم، مثل الطفرات، الحذف، وربما حتى الملاحق استخدام التكنولوجيات Cas9 كريبسر/21، أو التحوير حتى الملاحق لتوليد المحورة وراثيا أ. فيتريبينيس، التي ينبغي أن تعجل إلى حد كبير البحوث الفنية في هذا الحي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل جامعة كاليفورنيا سخية، مختبر (ريفرسايد) بدء الصندوق إلى O.S.A، معهد الأغذية الوطنية وزارة الزراعة والمشروع هاتش الزراعة (NIFA) (1009509) إلى O.S.A.
Materials
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
