וזמינותו התנהגותית עבור חוקרים את התפקיד של זיכרון מרחבי במהלך ההגנה אינסטינקטיבית בעכברים

כל הניסויים בוצעו תחת חוק חיות בבריטניה (וצפייה) משנת 1986 (PPL 70/7652), בעקבות אישור מוסרי המקומית. 1. הגדרת המנגנון התנהגותית הערה: המרכיב העיקרי של המנגנון התנהגותית הוא וריאציה של מבוך בארנס13 המורכב של אקריליק מעגלית משטח לבן (92 ס מ קוטר) עם 20 קו מקביל, בקוטר 5 ס מ, חורים עגולים, הממוקם בצורה רדיאלית, 5 ס מ מהקצה של פלטפורמת . 19 אלה הן ייסגרו עם תקע מפלסטיק שחור (5 מ”מ עמוק), בעוד החור הנותרים מוביל מקלט פרספקס שחור (מידות 15 x 5.8 x 4.7 ס”מ) כי עכברים יכולה בקלות להיכנס ולצאת. אזור מרכזי של הזירה מורכב פלטפורמה מעגלית קבוע (22 ס מ קוטר), הפריפריה הוא רכוב על מסגרת המאפשרת סיבוב מעל 360 מעלות באמצעות מנוע stepper מבוקר-מחשב. הפלטפורמה היא מוגברות של 45 ס מ מן הרצפה כדי למנוע העכברים יטפס למטה. ראו ציור סכמטי באיור1. לצרף רמזים חזותיים לפריפריה של פלטפורמת (2D או 3D סמלים עם צורות שונות, צבעים ותבניות), לפחות 2 ס”מ מהקצה כדי למנוע מעכברים מלהגיע אותם.הערה: דוגמאות ברמזים חזותיים הם ריבועים כחול רגיל של 262 ס מ2, או עיגולים (בקוטר של 15.5 ס”מ) מלא עם פסים סגולים אלכסוני. הוסף ~ 2 גר’ מצעים מהכלוב-העכבר הבית הפנימי של המקלט לשמש רמז חוש הריח מקומיים. באופן אופציונלי, מקם דיודה (LED) בכניסה למקלט כדי לספק רמז חזותי ציון מקומי. כדי לבודד את העכבר מ חיצוני, ברמזים חזותיים הדיסטלי, להרכיב קיר מתומן או גלילי, הרחבת 40 ס מ מעל ו 15 ס מ מתחת לפני השטח פלטפורמה, סביב הזירה, ממוקם 10 ס מ מהקצה של הפלטפורמה. הצב של רמקול סאונד 50 ס מ מעל המרכז של הפלטפורמה, כדי לספק aversive לגירויים שמיעתיים. במקום מסך שקוף 64 ס מ מעל הזירה כדי האחורי-פרוייקט גירויים חזותיים תקורה aversive שימוש במקרן. האור שמספק את המקרן תדלק את המנגנון התנהגותית; לכייל אותו כדי שלא יהיה 5-10 lx במרכז השטח פלטפורמה. מקום אורות אינפרא-אדום, מצלמה אינפרא אדום מעל הרציף, עם מסנן פס ארוך (> 700 nm) כדי למנוע הבהוב מקרן וידאו שנרכשו. לעקוב אחר המיקום של העכבר באינטרנט, באמצעות תוכנה זמינים מסחרית או באלגוריתם מתאימים. מעקב עכברים שחורים על ארנה לבן, פעולת קביעת סף פשוט ואחריו חישוב של centroid המסכה מתאימה. באופן אידיאלי, מקם את המנגנון התנהגותית בתוך קופסא של אור-אטומים, כדי למנוע סימנים חיצוניים המשפיעים על הניסוי. 2. מתן גירויים Aversive מולד הערה: הגירויים המתוארים להלן ניתן להפיק עם מגוון רחב של חבילות תוכנה שונים, לרבות LabVIEW Matlab. גירויים חזותיים פרוייקט הגירויים על המסך ממוקמת 64 ס מ מעל הזירה. הגירוי מורכב עיגול כהה מתרחבת באופן ליניארי על רקע אפור22 (וובר ניגוד =-0.98, הזוהר = 7.95 cd/m2).הערה: המעגל תקן אידיאלי צריך להיות מרוכז ישירות מעל המיקום של העכבר, subtending זווית ויזואלית של ° 2.6-תחילת ומרחיב באופן ליניארי-224 ° /s מעל 200 ms נמצא 47.4 °, בו נותר ms 250 לפני היסט. בעת העברת הגירוי החזותי, מרכז זה מעל העכבר. זו יכולה להיות מושגת על-ידי המתנה עד מצביע העכבר עובר דרך אזור מוגדר מראש בזירה, או על-ידי מעקב אחר המיקום העכבר באינטרנט ושימוש הקואורדינטות מעקב כדי להגדיר את מרכז המעגל.הערה: למרות אנו מציעים מקרין את הגירוי החזותי ישירות מעל העכבר, התנהגויות הגנה יכול גם להיות elicited אם הגירוי אותו מוקרן לפני העכבר (בעוד עדיין מקביל לרצפה). מניסיוננו, זהו המקרה לפחות עד 30 ס מ לפני העמדה של העכבר. גירוי שמיעתי לעורר גירוי המורכב של רכבת של שלושה מאופנן תדירות למעלה-הרייטינג של 17 עד 20 kHz23 מעל 3 s, שנמשך 9 s בסך הכל. רמת לחץ קול (SPL), נמדד ברמת פלטפורמה, צריך להיות בטווח בין 73 ו- 78 dB. להתחבר עם soundcard מגבר אל הדובר אולטרסאונד ממוקמת מעל הזירה כדי לספק את הגירוי השמיעתי. 3. בעלי חיים: השתמש עכברים C57BL/6J זכר או נקבה, בין בן 6 ו- 24 שבועות. לשמור על שהחיות על 12 שעות אור במחזוריות עם גישה חופשית אוכל ומים. להבטיח כי העכברים יחיד שוכנות לפחות 72 שעות לפני assay התנהגותית ובדיקה אותם במהלך שלב האור של האור מחזור.הערה: אנו מוצאים כי ההתנהגות גישוש בסיסית של עכברים שוכנים יחיד הוא יותר דומה על פני בעלי חיים מאשר על פני עכברים שוכנים קבוצה. בנוסף, בעלי חיים עם שתלים כירורגי עבור הקלטת פעילות עצבית או מניפולציה לעיתים קרובות צריך להיות יחיד שוכן, ובכך למאכסן יש שליטה datasets דיור באותם התנאים. 4. תקן Assay התנהגותיות: בקפידה לנקות את השטח של פלטפורמת עם 70% אתנול או חומצה אצטית להסיר רמזים חוש הריח לא רצויים. לשטוף את המקלט במים, לשטוף אותו עם אתנול 70%, לאחר מכן זה צריך לשטוף עם מים שוב כדי להפחית את הריח אתנול. יבש את הפלטפורמה והן למקלט ביסודיות, כמו העכבר עשוי להימנע מהזנת למחסה אם הוא רטוב. אקראי המיקום של בית המחסה של הפלטפורמה בכל ניסוי על-ידי סיבוב פלטפורמת לפני הניסוי. מיקום המקלט מעוגן בזירה אבל יהיה לסובב ביחס המתחם המנגנון התנהגותית. להביא את העכבר לחדר ניסוי בכלוב שלה הביתה ומניחים את הכלוב על גבי פלטפורמת בדיקה עבור תקופת הסתגלות של 10 דקות. להסיר את העכבר מכלובה מהבית ולהימנע מאחזר בזנב: גביע זה או זה לטפס על פריט העשרה שלא ניתן להעלות. אוסף עכברים בזנב כבר להראות כדי להגדיל את רמות החרדה, ובכך עלולה להשפיע על תגובות התנהגותיות איום24. בעדינות למקם העכבר במרכז הזירה ולהתחיל וידאו-הרכישה. לאפשר לתקופה habituation 7 דקות, במהלכן אין גירוי aversive מוצג. ודא העכבר יש מספיק זמן כדי לחפש ולהזין את המקלט לפחות פעם אחת. מחשיבים אותו בתור ערך אם כל ארבעת הגפיים נמצאים בתוך המקלט. 7 דקות צריך להיות מספיק עבור רוב העכברים למצוא ואת להיכנס למקלט, אבל במקרה זה לא קורה, להאריך את תקופת habituation מאת לתקופות נוספות של 5 דקות עד כניסה אחת לפחות אומתה. לעורר את המסירה של הגירוי aversive (שמיעתי או חזותי) או באופן ידני על ידי התבוננות על וידאו בשידור חי, או באופן אוטומטי על-ידי מעקב אחר המיקום של החיה באינטרנט והגדרת מראש אזור עניין בזירה עבור מפעילה גירוי-מסירה ברגע החיה מגיע אליו. הגירוי החזותי בדרך כלל מועבר ישירות מעל החיה באמצעות וידאו מקוון מעקב אחר נקודות ציון. לעורר תגובת הבריחה אחד או יותר במהלך אותה הפעלה, תן את העכבר בהתנדבות לצאת מהמקלט. אם העכבר בהצלחה לחמוק למקלט בעת הגירוי aversive האחרון, חכה לפחות 60 s לפני הצגת גירוי אחר. לאחר סיום וזמינותו, להחזיר את החיה בכלוב בבית. אם יש צורך בבדיקות נוספות של העכבר זהה, להמתין לפחות 48 שעות לפני שגוי. לנקות את הפלטפורמה ואת בית המחסה כפי שמתואר בשלב 4.1 ו- 4.2 לפני בדיקה החיה הבאה. הערה: שלבים 5, 6 ו- 7 הם וריאציות עצמאית של סטנדרט התנהגות וזמינותו, כל אחד יכול להתבצע באופן אינדיבידואלי. 5. ‘ ניווט אסטרטגיה’ Assay התנהגותיות: הערה: מטרת assay הזאת היא כדי לקבוע איזה רמזים עכברים השתמש להנחות התנהגות הבריחה. ב הזה assay, מטלטלין בחלק החיצוני של פלטפורמת מסובבים אמנם בעכבר על מרכז הזירה קבוע, אשר בצורה רדיאלית מזיחה למקלט, הותאם חוש הריח הממוקם בתוך המקלט, על רמזים חזותיים proximal קשורה לרציף. אם העכבר עוקב כל אחד המקלות זה כבר שסובבת על מנת לנווט למקלט, זה יברח כראוי אל המיקום החדש של המקלט, אבל אם היא משתמשת כל רמזים אחרים נשארו במקום, זה נווט אל מיקום מקלט הקודם. בצע שלבים 4.1 עד 4.8 של סטנדרט התנהגות וזמינותו שתוארה לעיל, הצליחו יותר במשיכת תגובה טיסה אחת לפחות כדי לשמש בסיס. תן את העכבר באופן פעיל לצאת מהמקלט. ולחכות שזה לנווט אל החלק המרכזי של הפלטפורמה. מקם צלחת קטנה עם מצעים במרכז לעודד את חקר ולשמור את החיה ברציף מרכזי ארוך מספיק כדי לאפשר את הסיבוב של החלק החיצוני של הפלטפורמה. הוסף את המנה ומצעים העכבר נמצא בתוך המקלט ואילו לאחר הבריחה מוצלחת אחרי זה הסיבוב של הפלטפורמה. אם העכבר נכשל להיכנס למקלט במהלך התגובה לברוח, המתן עד בהתנדבות להיכנס למקלט ולאחר מכן להוסיף את המנה ומצעים. השתמש המנוע stepper סובב את פלטפורמת לפחות 36 מעלות (2 חורים) ולאחר מכן להשתמש מיד גירוי חושי להפיק תשובה לברוח. זה אפשרי כי הסיבוב מפעיל להבהיל, אפילו יוזם מענה לברוח.הערה: מהניסיון שלנו, ~ 55% של העכברים יפעלו מחוץ לפלטפורמה המרכזית (לא מסתובב) ואילו החלק החיצוני עדיין מסתובב, נסיונות אלו לא להיות כלולים בניתוח. לנקות את פלטפורמת ומחסה, וחוזרים העכבר שלו הביתה כלוב כפי שמתואר בשלב 4.10 ו- 4.11. 6. “סביבה דינאמית’ Assay התנהגותיות: הערה: assay הזה נועד להעריך כמה עכברים להסתגל שלהם התנהגויות הגנתי על שינויים פתאומיים בסביבה. בניסויים אלה, לאחר הצליחו יותר במשיכת תגובה לפחות אחד לברוח, שינוי המיקום של המקלט, העכבר מותר לבקר אותה פעם אחת לפני בריחה שלאחר מכן מופעלת בתגובה. אם העכבר בצורה מושלמת מעדכן את המיקום החדש של המקלט, מחשבת את העדר של המקלט במיקום הקודם שלה, זה צריך לברוח אל המיקום החדש. אחרת, זה לא בעל המיקום החדש של המקלט או זה בעל שני המקומות אבל מעדיף לברוח עם הקודם. בצע הזה assay לאחר השלבים 4.1 עד 4.8 שתוארה לעיל, הצליחו יותר במשיכת תגובה אחת לפחות טיסה כפקד. ברגע העכבר עוזב מרצונו החופשי למקלט, להסיר את המקלט, ולמקם אותו מחדש בחור חדש בקצה הנגדי של הפלטפורמה. לאפשר את העכבר כדי לחקור את הסביבה עד שהוא יעבור את המקלט במיקום החדש. כאשר העכבר מרצון מגיע מהמקלט, נוכח זה עם גירוי aversive, לבחון את תגובתה. להשתמש את הגירוי השמיעתי לניסוי הזה בגלל משך זמן שלה, כמו תחת איום ממושך, בעלי חיים ניתן לבצע תגובות נוספות לברוח למקומות אחרים אם הם נכשלים למצוא את המקלט בהתחלה. לנקות את פלטפורמת ומחסה וחוזרים העכבר שלו הביתה כלוב כפי שתואר בשלבים 4.10 ו- 4.11. 7. ‘ מקלט’ Assay התנהגותיות: הערה: מטרת assay הזה הוא להבין כיצד העדר מקלט מפני הסביבה משפיעה על הביטוי של התנהגויות הגנתית. חבר את כל החורים 20. בניסוי זה, יש מקלט בזירה. לאחר ניקוי וייבוש הפלטפורמה (שלבים 4.1 ו- 4.2), לבצע את השלבים 4.4-4.6. לאפשר תקופה habituation 7 דקות. להציג את הגירוי החזותי ולבחון את התגובה ההגנתית. העדר מקלט מקדם התנהגות קופא, בדרך כלל שנמשך משך הזמן של הגירוי החזותי. להשתמש במקום הרחבת לאט (למשל. עיגול subtends זווית ויזואלית של ° 2.6-תחילת ומרחיבה באופן ליניארי-° 11.2 /s מעל 4 s ° נמצא 47.4, בו נותר 1 s לפני קיזוז) כדי להקל על התצפית להקפאת תגובות. אם נדרשת תגובה יותר מפעם אחת לכל העכבר, להשתמש במרווח הבין-גירוי לפחות 60 s. לאחר השגת את המספר הנדרש של תגובות, בהעדר בית-המחסה, להציג את בית המחסה מתחת לאחד החורים, תן העכבר לחקור את הסביבה על פחות 5 דק 5 דקות יהיה מספיק זמן במרבית העכברים לחפש ולהזין את המקלט החדש הציג , אבל במקרה זה לא קורה, להאריך תקופה זו על ידי 5 דקות נוספות בלוקים עד אימות כניסה אחד לפחות. חזור על שלבים 4.8 ו- 4.9, ולבחון את הבריחה תגובות לבצע בנוכחות מקלט בסביבה. לנקות את פלטפורמת ומחסה וחוזרים העכבר שלו הביתה כלוב כפי שתואר בשלבים 4.10 ו- 4.11. 8. נתוני ניתוח: הערה: כל אחד השלבים הבאים של ניתוח נתונים ניתן לבצע באופן עצמאי. הבריחה תגובות ניתן לזהות בקלות בכל האצה פתאומית בעקבות הצגת הגירוי aversive. לכמת ההשהיה לברוח משך הזמן בין הגירוי מצגת תחילתה של תנועה סיבוב הראש מכוון היעד של הבריחה או תחילת התנועה האצה, מה שיבוא קודם. הקפאת תגובות יכול להיות מאופיין על ידי נייחות הכוללת של החיה חוץ נושם תנועות25, שנמשך לפחות 0.5 s7. למדוד ההשהיה להקפיא את משך הזמן בין הצגת הגירוי aversive תחילת תקופת נייחות. עבור כל תגובה לברוח, לכמת על ליניאריות של נתיב הטיסה על-ידי חישוב היחס בין המרחק בין העכבר ואת המחסה העקירה בפועל במהלך הטיסה. עבור כל תגובה לברוח, לחשב את רמת הדיוק על ידי מדידת המרחק בין החור שבו החיה ביים את הטיסה החור המוביל למקלט. מאז יש חורים 20, כל חור מהמטרה מייצג של הקטנת של 10% ברמת הדיוק (למשל., 2 חורים מהמטרה יכולה להתבטא כ 80% דיוק) עבור ‘ניווט אסטרטגיה’ וזמינותו התנהגותית, לכמת את הדיוק של התגובה יחסיים למיקום מחסה לפני הסיבוב פלטפורמה. דיוק ממוצע שאינו שונה באופן מהותי מן הדיוק סיבוב מראש מציינת החיה לא משתמש כל אחד המקלות חושי זה היו לסובב כדי לנווט אל המטרה לברוח. עבור ‘סביבה דינאמית’ וזמינותו התנהגותית, לסווג כל תגובה לברוח elicited כמו להיות מכוונת כלפי החדש או את מיקום המקלט הישן, או אף אחד מהם. להעריך איך התבנית מתפתח לאורך חזרות של ההתנהגויות הגנתי elicited. עבור ‘מקלט’ וזמינותו התנהגותית, להשוות בין המהירות של העכבר בעקבות המצגת של גירויים חזותיים aversive הנוכחות ואת העדר מקלט ולחשב ההשהיה כדי אתחול של התגובה ההגנתית. בנוסף, לחשב את ההסתברות של מפעילה תגובה מקפיא בתגובה הגירוי לכל מצב.