Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas
Summary
Os ratos representam um modelo inestimável na vivo para estudar a infecção e doenças causadas por microorganismos gastrointestinais. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para estudar a colonização bacteriana e alterações histopatológicas em modelos do rato do Helicobacter pylori-doenças relacionadas.
Abstract
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico que está presente em metade da população mundial e é uma importante causa de morbidade e mortalidade em seres humanos. Vários modelos de rato da infecção gástrica por Helicobacter foram desenvolvidos para estudar os mecanismos moleculares e celulares, segundo o qual a bactéria H. pylori coloniza o estômago de hospedeiros humanos e causar doença. Aqui, descrevemos os protocolos: 1) preparar suspensões bacterianas para a infecção na vivo de ratos através de gavagem intragástrico; 2) determinar os níveis de colonização bacteriana nos tecidos gástricos de rato, por reação em cadeia da polimerase (PCR) e a contagem viável; e 3) avaliar as alterações patológicas, pela histologia. Para estabelecer Helicobacter infecção em ratos, os animais (SPF) isentos de agentes patogénicos específicos primeiro são inoculados com suspensões (contendo ≥ 105 unidades formadoras de colônia, CFUs) de cepas de rato-colonização de qualquer Helicobacter pylori ou outros gástrica spp. Helicobacter de animais, tais como felis Helicobacter. A pós-infecção pontos de tempo apropriado, estômagos são extirpados e dissecados essas em dois fragmentos de tecido igual, cada um compreendendo as regiões de antro e corpo. Dentre estes fragmentos é usado para contagem viável ou extração de DNA, enquanto o outro é submetido a processamento histológico. Colonização bacteriana e alterações histopatológicas no estômago poderão ser avaliadas rotineiramente em seções do tecido gástrico manchadas de Warthin-Starry, Giemsa ou hematoxilina e eosina (H & E) manchas, conforme apropriado. Análises imunológicas adicionais também podem ser efectuadas por imuno-histoquímica ou imunofluorescência em secções de tecido gástrico de rato. Os protocolos descritos abaixo são projetados especificamente para permitir a avaliação em ratos de patologias gástricas, parecidos com os de humanos relacionados com H. pylori doenças, incluindo inflamação, atrofia da glândula e formação de folículos linfoides. A preparação do inóculo e protocolos de gavage intragástrico também podem ser adaptados para estudar a patogênese de outros patógenos humanos entéricos que colonizam a ratos, tais como Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico em forma de espiral, Gram-negativo, humano presente em todas as populações em todo o mundo, com taxas de infecção nos países em desenvolvimento, estima-se que na ordem de 80%1. Embora a maioria dos H. pylori-indivíduos infectados são assintomáticos, alguns desenvolvem doenças mais graves, variando de ulceração péptica a câncer gástrico2. H. pylori-cancros associados amplamente são caracterizadas por alterações malignas nas células epiteliais (GECs) ou pela formação de tecidos linfoides extra nodais no estômago, resultando em adenocarcinoma gástrico ou mucosa associada linfoide linfoma do tecido (MALT), respectivamente. H. pylori é altamente adaptado para sobreviver no nicho ecológico duro do estômago devido à presença de vários fatores de virulência e mecanismos para facilitar a sua aderência, o crescimento e o metabolismo nesse nicho. Em particular, cepas virulentas de H. pylori possuem a 40KB cag ilha de patogenicidade (cagPascoal) que codifica aproximadamente 30 genes necessários para a produção de um tipo 4 secreção system (T4SS)3,4 . CAG Pascoal-positivo cepas de H. pylori são associadas com a indução de níveis mais elevados de inflamação crônica no acolhimento, que tem sido implicado como um precursor essencial do adenocarcinoma gástrico5.
Na vivo modelos animais, particularmente os ratos, tem sido altamente informativos, permitindo que os pesquisadores a investigar as contribuições relativas de anfitrião, bacterianas e condições ambientais na infecção pelo H. pylori e doença resultado6. Estudos têm demonstrado anteriormente que prolongou o H. pylori infecção de ratos sobre os resultados do fundo genético de C57BL/6 no desenvolvimento da gastrite crônica e glândula atrofia, as duas principais características do H. pylori infecção7. Além disso, a infecção com as espécies bacterianas relacionadas canino/felino, a H. felis, foi mostrada para induzir a formação de malte em camundongos com patologia semelhante e progressão da doença, visto na humana malte linfoma8,9. O mais comumente usado o H. pylori isolada em estudos de colonização do rato é o “Sydney tensão 1” (SS1) tensão10, que é o cagPascoal+ , mas tem um T4SS não-funcional (T4SS−)11. Outras cepas amplamente utilizadas incluem H. pylori B128 7.13 (cagPascoal+/T4SS+)12 e X47-2AL (cagPascoal–/T4SS−)13. Para H. felis infecções, a estirpe CS1 (“gato espiral 1”, cagPascoal–/T4SS−) é usado geralmente14.
Neste documento, nós fornecemos um protocolo descrevendo a preparação de inóculos de Helicobacter infecção na vivo , o procedimento para gavage intragástrico de ratos, bem como métodos para o processamento dos tecidos para o estudo das alterações histopatológicas no estômago. Em particular, este artigo focalizará os métodos histológicos usado para visualizar a colonização bacteriana e avaliar as mudanças histopatológicas, incluindo formação de malte, na mucosa gástrica de ratos infectados. Alguns dos métodos descritos aqui podem ser adaptados para o estudo de outros patógenos de intestino como S. Typhimurium ou c. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a utilização de um modelo de rato in vivo de Helicobacter infecção. Os passos críticos do processo são a: 1) preparação de inóculos de Helicobacter contendo bactérias motile e viáveis; 2) a entrega dos números adequados de bactérias para o mouse através de gavagem intragástrico; 3) a detecção da infecção bacteriana por contagem de colônia e/ou PCR; e 4) processamento de tecidos gástricos para permitir a avaliação da histopatologia em infectados est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a Sra. r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann para assistência técnica. Os autores reconhecem a utilização das instalações e assistência técnica da plataforma de histologia de Monash, departamento de anatomia e biologia do desenvolvimento, Universidade de Monash. O laboratório é suportado pelo financiamento da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para RLF (APP1079930, APP1107930). RLF é apoiado por uma bolsa de pesquisa sênior do NHMRC (APP1079904). KD e MC são suportados por bolsas de pós-graduação de Monash. KD também é apoiado pelo centro de imunidade inata e infecciosa doenças, Hudson Instituto de pesquisa médica, enquanto MC tem uma bolsa de pós-graduação internacional desde a faculdade de medicina, enfermagem e Ciências da saúde, Universidade de Monash. Pesquisa no Instituto de investigação médica Hudson é suportada pelo programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
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