نماذج الماوس الملوية العدوى وأمراض المعدة
Summary
الفئران تمثل نموذجا لا تقدر بثمن في فيفو لدراسة العدوى والأمراض التي تسببها الكائنات الدقيقة المعدية المعوية. هنا، يمكننا وصف الطرق المستخدمة لدراسة الاستعمار الجرثومي وتغييرات نسيجية في نماذج الماوس الملوية البوابية-المتعلقة بالمرض.
Abstract
الملوية البوابية هو ممرض المعدة في نصف سكان العالم وهو سببا هاما للمراضة والوفيات لدى البشر. تم تطوير عدة نماذج الماوس المعدة الملوية العدوى دراسة الآليات الجزيئية والخلوية حيث H. pylori البكتيريا استعمار معدّة المضيفين الإنسان وتسبب المرض. هنا، يمكننا وصف البروتوكولات إلى: 1) تعد المعلقات البكتيرية للعدوى في فيفو من الفئران عن طريق إجراء تزقيمية مدتها؛ 2) تحديد مستويات الاستعمار الجرثومي في أنسجة المعدة الماوس، بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والعد قابلة للتطبيق؛ و 3) تقييم التغيرات المرضية، بعلم الأنسجة. لإنشاء هيليكوباكتer العدوى في الفئران، أولاً هي تلقيح الحيوانات (منتدى جنوب المحيط الهادئ) خالية من مسببات الأمراض خاصة مع تعليق (التي تحتوي على إيه وان زيرو5 الوحدات المكونة للمستعمرة، كفوس) من سلالات استعمار الماوس أما الملوية البوابية أو أخرى spp. الملوية المعدة من الحيوانات، مثل حطي الملوية. في العدوى بعد النقاط الزمنية المناسبة، اقتطعت بطون وتشريح ساجيتالي إلى أجزاء متساوية الأنسجة اثنين، كل منها يتألف من مناطق الجسم والتجويف. واحدة من هذه الشظايا ثم يستخدم للعد قابلة للتطبيق أو استخراج الحمض النووي، بينما الآخر يخضع لتجهيز غذائها. يمكن تقييم الاستعمار الجرثومي وتغييرات نسيجية في المعدة بشكل روتيني في أقسام الأنسجة المعدة ملطخة ببقع (H & E) النجوم Warthin، جيمسى أو هايماتوكسيلين وويوزين، حسب الاقتضاء. التحاليل المناعية إضافية قد تضطلع أيضا إيمونوهيستوتشيميستري أو الفلورة على أبواب أنسجة المعدة الماوس. البروتوكولات المبينة أدناه مصممة خصيصا لتمكين تقييم أمراض المعدة تشبه تلك التي تتعلق بالإنسان H. pylori في الفئران الأمراض، بما في ذلك التهاب وضمور الغدة وتشكيل جريب اللمفاوية. إعداد العدوى والبروتوكولات تزقيمية إجراء يمكن تكييفها لدراسة أمراض أخرى تصيب الإنسان المعوية أن استعمار الفئران، مثل Typhimurium السالمونيلا أو رودينتيوم المضاداتأيضا.
Introduction
الملوية البوابية ممرض المعدة على شكل دوامة، سلبية الغرام، والبشرية موجودة في جميع السكان عبر العالم، مع معدلات الإصابة في البلدان النامية وتقدر بحدود 80%1. على الرغم من أن معظم H. pylori-الأفراد المصابين بأعراض، ووضع بعض أشد الأمراض، بدءاً من تقرح الهضمية بسرطان المعدة2. H. pylori-تتميز السرطانات المرتبطة بها على نطاق واسع بتغييرات خبيثة في الخلايا الظهارية (جيكس) أو بتشكيل العقدي خارج الأنسجة اللمفاوية في المعدة، ونتج عنه غدية المعدة أو المرتبطة بالغشاء المخاطي الليمفاوي سرطان الغدد الليمفاوية الأنسجة (الشعير)، على التوالي. H. pylori هو تكييف عالية البقاء على قيد الحياة في مكانة الإيكولوجية القاسية في المعدة بسبب وجود عدة عوامل الفوعة واليات تيسير الانضمام، والنمو والايض في مكانة هذا. على وجه الخصوص، تمتلك خبثاً سلالات H. pylori كيلو بايت 40 كاج الجزيرة الإمراضية (cagPAI) الذي يشفر حوالي 30 الجينات المطلوبة للإنتاج من نوع 4 إفراز نظام (T4SS)3،4 . المساعدة النقدية PAI-إيجابية سلالات H. pylori المرتبطة بتنظيم دورات تعريفية لمستويات أعلى من التهاب مزمن في البلد المضيف، والذي كان متورطا باعتبارها مؤشرا أساسيا للمعدة غدية5.
وكانت في فيفو نماذج حيوانية، لا سيما من الفئران، الزاخر بالسماح للباحثين بالتحقيق في المساهمة النسبية للمضيف، والعوامل الجرثومية والبيئية على H. pylori العدوى والمرض نتيجة6. سبق وقد أثبتت الدراسات أن تطول H. pylori عدوى فئران على نتائج الخلفية الوراثية C57BL/6 في تطوير التهاب المعدة المزمن وغده ضمور، كلا من السمات المميزة ل عدوى H. pylori 7. وعلاوة على ذلك، قد تبين الإصابة بالأنواع البكتيرية القطط/الكلاب ذات الصلة، حطي حاء، للحث على تشكيل الشعير في الفئران مع أمراض مماثلة وتطور المرض كما رأينا في لمفوما مالت البشرية8،9. H. pylori الأكثر استخداماً هو عزل في دراسات الاستعمار الماوس “سيدني سلالة 1” (SS1) سلالة10الذي كاجالباي+ ولكن من T4SS غير وظيفية (T4SS−)11. السلالات الأخرى المستخدمة على نطاق واسع تشمل H. pylori B128 7.13 (كاجالباي+/T4SS+)12 و X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. للالتهابات حطي حاء ، سلالة CS1 (“القط دوامة 1″، كاجالباي–/T4SS−) هو عموما يستخدم14.
وهنا، نحن نقدم بروتوكول وصف إعداد لقاح الملوية للعدوى في الجسم الحي ، والإجراءات المتعلقة بإجراء تزقيمية الفئران، فضلا عن أساليب لمعالجة الأنسجة لدراسة التغيرات التشريحية المرضية في المعدة. على وجه الخصوص، هذه المادة سوف تركز على غذائها الأساليب المستخدمة لتصور الاستعمار الجرثومي وتقييم التغيرات التشريحية المرضية، بما في ذلك تشكيل الشعير، وفي الغشاء المخاطي المعدة من الفئران المصابة. قد تكون بعض الأساليب الموصوفة هنا تتكيف مع دراسة أخرى مسببات أمراض الأمعاء مثل س. تيفيموريوم أو C. رودينتيوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول استخدام طراز الماوس في فيفو لعدوى الملوية . الخطوات الحاسمة من الإجراءات: 1) إعداد لقاح الملوية التي تحتوي على البكتيريا قادرة على البقاء ومتحركة؛ 2) تسليم الأرقام المناسبة للبكتيريا للماوس عبر إجراء تزقيمية مدتها؛ 3) الكشف عن العدوى البكتيرية بالعد مستعم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر السيدة أ دي Paoli والسيدة جورجي رأي-ماكان للمساعدة التقنية. الكتاب تقر استخدام التسهيلات والمساعدة التقنية من منصة موناش علم الأنسجة وقسم علم التشريح وعلم الأحياء التنموي، جامعة موناش. المختبر هو مدعومة بتمويل من “الوطنية للصحة” ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) إلى RLF (APP1079930، APP1107930). ويدعم RLF “زمالة للبحث أقدم” من NHMRC (APP1079904). دينار كويتي ومولودية تدعمها سواء في “موناش الدراسات العليا المنح الدراسية”. دينار كويتي أيضا معتمد من قبل المركز للحصانة الفطرية والأمراض المعدية، ومعهد هدسون للأبحاث الطبية، في حين MC “المنح الدراسية الدولية بعد التخرج” من كلية الطب والتمريض والعلوم الصحية، جامعة موناش. أبحاث في “معهد هدسون للأبحاث الطبية” معتمد من قبل “التنفيذية برنامج الحكومة الفيكتوري دعم البنية التحتية”.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
