JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Published: August 28, 2018
doi:
10.3791/56969
, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University

Summary

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Abstract

Kümelenmiş, karakterizasyonu düzenli olarak interspaced, Streptococcus pyogenes (CRISPR) sistemi hızla geniş çeşitli gen değişiklikleri oluşturmak için özelleştirilebilir bir platform gelişimi sağladı kısa, palindromik tekrar organizmalar, zebra balığı da dahil olmak üzere. Genom CRISPR tabanlı düzenleme tek kılavuz RNA (sgRNA) CRISPR ilişkili (Cas) endonükleaz ilgi, genomik DNA (gDNA) hedefine hedeflemek için nerede iki iplikçikli mola (DSB) Cas endonükleaz oluşturur kullanır. DSBs onarım hataya mekanizmaları kurşun eklemeleri ve/veya silme (indels) tarafından. Bu kez erken kodonu böylece bir protein-null alleli oluştururken kodlama dizisi içinde tanıtmak frameshift mutasyonlar neden olabilir. CRISPR tabanlı genom mühendislik yalnızca birkaç moleküler bileşenleri gerektirir ve kolayca zebra balığı embriyo mikroenjeksiyon tarafından tanıtıldı. Bu iletişim kuralı CRISPR kimyasalları zebra balığı mikroenjeksiyon üretmek için ve CRISPR modifiye gen aktarımını germline sergilenmesi balık tanımlamak için kullanılan yöntemleri açıklar. Bu yöntemler, sgRNAs, mikroenjeksiyon, CRISPR reaktifler, indels bir heteroduplex hareketlilik tahlil (HMA), malzemelerin ve indels adı verilen bir PCR tabanlı yöntem kullanarak hedef sitesinde indüklenen tanımlaması içinde vitro transkripsiyon içerir iş hızı düşük ve güçlü yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak-Heterozigoz balık toplanan birden fazla PCR ürünleri analiz edebilirsiniz yaklaşım alarak. Bu iletişim kuralı çözümlemesi için gerekli ekipman türleri ve gerekli balık sayısını en aza indirmek için kesintisiz hale getirilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı kullanımı için mükellef olarak laboratuvar Kişisel lisans öğrencileri, ekonomik olarak CRISPR tabanlı gerçekleştirmede baktılar herhangi bir araştırma grubu tarafından istihdam edilecek bu güçlü aracı etkinleştirme dahil deneyimi her seviyedeki tarafından tasarlanmıştır zebra balığı genomik değişiklik.

Introduction

Ökaryotlar arasında Moleküler makineler korunması için araştırma model organizmalar kullanarak güç altında yatan. Bu modeli sistemlerin pek çok gen ürünü bir biyolojik veya hastalık işleme ilgi katkısını karakterize etmek için hedeflenen gen altını gizleme gibi ters genetik yaklaşımlar kullanımını kolaylaştırmak. Gene bozulma teknikleri zebra balığı gibi organizmalar üzerinde DSBs1,2imprecise tamiri neden frameshift mutasyonların hedeflenen giriş tarihsel yararlanmıştır. Bir DSB genom tanıttığında, DNA lezyon neredeyse tüm hücre tipleri ve organizmaların evrensel olarak mevcut iki yolları biri aracılığıyla tamir: homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma ve Homoloji yönetmen onarım (HDR)3,4 . NHEJ makine imprecise doğası sık sık çeşitli uzunlukları5,6,7,8,9indels üretir. Giriş bir genin kodlama dizisi frameshift mutasyonların kez gen işlevsel olmayan işler bir erken kodonu, üretebilir.

Meganucleases, çinko-parmak nükleaz ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz, tüm bunların bir nükleaz genomik belirli bir hedef için DNA-protein etkileşimler kullanılan zebra balığı indels tanıtmak için erken genom mühendislik stratejileri dahil hedef nerede DSB10,11,12,13,14,15tanıttı. Ancak, bu teknolojilerin genellikle faiz DNA dizisi hedefleyen bir nükleaz görüntüyü artırmak için gerekli zahmetli ve karmaşık mühendislik nedeniyle uygulamak zordur. Önceki stratejileri gen CRISPR tabanlı düzenleme hedefleme için protein-DNA etkileşimleri dayanmaz. Bunun yerine, CRISPR ilişkili (Cas) endonükleaz nükleotit etkileşimleri eşleştirme temel faiz16,17,18,19 genomik bir site hedeflemek için kullandığı bir RNA Kılavuzu yönlendirilir ,20,21. Bir RNA tasarlama basitliği nedeniyle Kılavuzu ile etkileşimleri bu hedefleme için eşleştirme istenen Bankası Cas endonükleaz istenen odağı için hedef nispeten kolaydır. Tip II CRISPR sistemi özellikle yaygın endonükleaz etkinliği uyarmak için DNA ile etkileşim gerektiren bir tek etki alanlı Cas nükleaz (Cas9) kullanımı da dahil olmak üzere birçok avantajlı özellikleri nedeniyle genom düzenleme uygulamaları için geliştirilmiştir ve soydaş DNA dizisi18için hedef için bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) kullanın. Sıra gereksinimleri soydaş sgRNA hedefleme için gerekli iyi anlaşılan19, ve istenen sgRNA kolayca vitro transkripsiyon tarafından oluşturulur. Sadelik ve sağlamlık CRISPR/Cas9 yaklaşımın büyük zebra balığı ve diğer organizmalar zengin çeşitte hedeflenen genetik değişiklik kolaylaştırır.

Zebra balığı reaktifler CRISPR tabanlı geliştirme sonucu olarak hedeflenen genom düzenleme önemli ölçüde vardır taahhüt yeteneği gelişmiş omurgalı canlıların sinir merkezi geliştirme gibi sembolik işlemler çalışma fırsatı arttı sistem. Zebra balığı genom orthologs insan genomu hem de insanlar22hastalıkları ile ilişkili genlerin % 84 bulundu protein kodlayıcı genlerin % 70 içerir. Zebra balığı geliştirme sergileyen kullanımı ters genetik çalışmalarda geliştirmek birkaç anahtar nitelikler: embriyo büyük debriyajlar koyulur, dışarıdan mikroenjeksiyon ve yetişkin zebra balığı tarafından mükellef genetik manipülasyon geliştirmelerde anneden geliştirmek 3 ay-in yaş, istediğiniz satırları23hızlı yayılması için izin tarafından cinsel olgun.

Çok sayıda iletişim kurallarının yaklaşımlar oluşturmak ve CRISPR elde edilen indels zebra balığı24,25,26,27,28,29 olarak tanımlamak için çeşitli tarif ,30,31. Ancak, bu yordamları birçoğu zaman yoğun, pahalı ekipmanlara erişim gerektiren ve labs ile sınırlı uzmanlık için zor olabilir. Burada açıklanan adımları bir basit, sağlam ve ekonomik CRISPR/Cas9-stratejisi mühendis zebra balığı nakavt satırlarına sağlayabilir. Bu iletişim kuralı DNA oligonucleotides (oligos) kullanarak sgRNAs sentezlemek için son derece verimli bir kit açıklar, benzer olmuştur diğer yaklaşımlar için daha önce açıklanan32. Açıklanan protokol iki adımları özellikle büyük ölçüde kolaylaştıran çizgiler CRISPR mutasyona uğramış analizini içerir: adım adım kolayca genom değişiklikler varlığı ve sıralama Analizi belirlemek için PCR tabanlı HMA33 kullanımı hızla ve kolayca birden çok indels ekonomik bir biçimde sebebini bulmaya Heterozigoz zebra balığı. Buna ek olarak, adım adım yönergeler seçimi sağlam, güvenilir üretim ve Enjeksiyon Kılavuzu RNA’ların için dahil edilir. Burada sağlanan adımlar zebra balığı gen knockouts tanımlaması için katkıda bulunmak laboratuar personeli uzmanlık bir dizi sağlayan sağlam, nispeten ucuz protokol örnekler.

Protocol

Bu çalışma Kılavuzu’nda bulunan öneriler için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri ile sıkı uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol Purdue hayvan bakım ve kullanım Komitesi (PACUC sayı 08-031-11) tarafından kabul edildi. 1. tasarım şablonu özel Oligos Kılavuzu RNA üretim için Genin kodlama bölgede değişiklik ilgi hedef bölgeyi seçin. Bu 5′ uç bir kesilmiş protein oluşturur, ancak böyle bir sonraki çerçeve başlama kodonu ile mütevazı bir N-terminal kesme bir protein üretimini sağlar uzak için gen yakın olması gerekir.Not: içinde bir çerçeve başlatmak için kodon aşağı akım Kodlayıcı bölge genin taramak için bu olasılığı önlemek için bir yol var. Buna ek olarak, bir büyük exon ortasına hedefleyen RNA kılavuz kullanarak, sonraki elde edilen INDEL Puanlama için PCR astar tanımlamak için yardımcı olabilir. RNA seçimi kılavuz kullanarak ilgi genomik bölgedeki potansiyel Rehberi siteleri belirlemek programı (bakınız Tablo reçetesi)34,35,36. Danio rerio ve 5′-NGG-3 protospacer bitişik motifi (PAM) serisine tarayıcı veri kümesi ‘.Not: Bir 5 ‘-G gRNA verimli T7 vitro transkripsiyon için ilk pozisyonda Ideal gRNA sıraları içerir. Kabul edilebilir hiçbir rehber ile bir G 5’konumundaki bulunmuş gibi görünüyorsa, başka bir rehber 5’temeli için değiştirilebilir bir G veya bir G Kılavuzu RNA 5’sonuna eklenebilir, ancak bu kesme verimliliği37azaltabilir. Kesme verimliliği maksimize etmek için en iyi rehber dizisi % 40-80 GC içeriğe sahip (daha yüksek olduğunu daha iyi) ve bir G konumunda 20th , PAM için bitişik içerir ancak gerekli38değildir. İdeal bir hedef sıra bir örnek: 5 ‘ – G (N)18 G-3 ‘ – NGG (NGG mi PAM). En iyi rehber yukarıda açıklandığı gibi RNA’ları tanımlamak için Kılavuzu RNA seçim programı sonuçlarını inceleyerek yanı sıra bakım kılavuzu RNA’ların büyük ölçüde aşağı akım Analizi karmaşık hale tahmin edilen güçlü hedef kapalı efektleri ile önlemek için alınmalıdır. Özellikle, RNA’lar ile sonbahar Kodlayıcı bölgeler içinde tutulmalıdır ve öngörülen toplam kapalı hedef siteleri indirilmelidir öngörülen hedef kapalı etkileri Kılavuzu. PAM sıra Kılavuzu RNA tasarım aracı çıktısı hariç (5 ‘-NGG-3 ‘); Bu hedefleme için kullanılır ama Cas9 bölünme için tanıma sırasını oluşur. Kalan 20 nükleotit için (nts), T7 organizatörü sıra ve örtüşme sıralaması (bölge için önerilen vitro transkripsiyon kit ile sağlanan tam uzunlukta sgRNAs sentez için kullanılan bir iskele oligo tamamlayıcı) eklemek belirtilen sırada 54 nt oligo elde etmek için aşağıdaki: T7 organizatörü sıra: 5 ‘-TTCTAATACGACTCACTATA-3 ‘; RNA dizisi 5 ‘ – G (N)18 G rehberlik-3 ‘; Sıra üst üste: 5 ‘-GTTTTAGAGCTAGA-3 ‘ Tahmin edilen kesme makinası kanattan PCR astar tanımlamak (Cas9 cleaves 3 nt akıntıya karşı PAM sırası) olarak 50-150 baz çifti (bp) her web tabanlı yazılım kullanarak kesme gelen ( Tablo malzemelerigörmek).Not: Bunlar daha sonraki bir adımda kesme verimliliği ölçüm için kullanılan. Hiçbir uygun astar bu kısıtlamaları’nı kullanarak tanımlanır dikkate alınması gereken başka bir Kılavuzu RNA site gerekebilir. Rehber üretmek için 54 nt oligonucleotides RNA ve PCR astar ( Tablo malzemelerigörmek) hedef siteleri çözümlenmesi için sipariş.Not: isteğe bağlı olumlu kumanda, bir sgRNA bir gen kolayca attı bir görsel fenotip bu iletişim kuralı’nı performansını doğrulamak için pigment üretimi için gerekli hedefleme üretmek yararlı olabilir ( Şekil 1 temsilcisi sonuçları elde etmek için bakınız). Oligo kullanarak gen tirozinaz, ortak bir hedeftir (Kılavuzu RNA dizisi altı çizili)39: 5 ‘-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 ‘ 2. embriyo mikroenjeksiyon için CRISPR-reaktifler hazırlanması Piyasada bulunan Cas9 protein sipariş (tablo malzemeleri görmek).Not: zebra balığı embriyo mikroenjeksiyon Cas9 protein ile daha verimli32,42olmak göstermiştir ancak enjeksiyon Cas9 mRNA da indels zebra balığı40,41yılında, üretmek için kullanılabilir. Cas9 protein 1 mg/mL solüsyon oluşturmak için sağlanan arabellek içinde askıya alma. Çözüm enjeksiyon-hazır aliquots PCR tüpler donma-çözülme devir sayısını en aza indirmek için-80 ° C’de depolayın. Bir 5 µL enjeksiyon çözüm, 1 mg/ml Cas9 çözüm kullanılır, 2 µL oluşturmak için bu nedenle Cas9 PCR şerit-tüpler kullanarak 2 µL aliquots bölünmemeli olabilir. SgRNA vitro transkripsiyon kullanarak sgRNA sentez ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Vitro transkripsiyon üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.Not: Sırasında tüm sentez, temizlik ve enjeksiyon çözüm hazırlık adımları RNase free tekniği korumak. Örneğin, tek kullanımlık eldiven kullanın ve bunları sık sık değiştirin, tüpler ve sertifikalı RNase free ve temiz yüzeyler ve aygıtlar dezenfekte etmek için piyasada bulunan çözümleri ile pipetler ipuçları kullanın (bkz. Tablo malzeme). RNase free tekniği kullanarak bir amonyum/asetat yağış kullanarak sentezlenmiş sgRNA arındırmak.Not: Alternatif olarak, piyasada bulunan sütunlara göre RNA kitleri kadar temiz çeşitli nispeten mütevazı bir ücretle kullanarak sgRNAs saf. 5 M amonyum asetat ve iyice karıştırın girdap 25 µL ekleyin.Not: Amonyum asetat eriyik piyasada bulunan (bakınız Tablo malzemeler), ya da 5 M çözüm için 1 mL su RNase free moleküler sınıf amonyum asetat 385.4 mg ekleyerek evde yapılan ve -20 ° C’de depolanan 200-proof nükleaz ücretsiz etanol 150 µL her örnek için ekleyin. Reaksiyon en az 20 dk-80 ° C dondurucuya koyun.Not: Örnekleri gecede-80 ° C’de depolanabilir, ancak önemli ölçüde toplam RNA verim artışı değil. Maksimum hızda örnekler santrifüj kapasitesi (> 16.000 x g) 4 ° C microcentrifuge 20 dakika içinde. Süpernatant dikkatli bir şekilde yavaş yavaş sıvı RNA Pelet rahatsız sağlanması, pipetting tarafından çıkarın. 1 mL % 70 etanol (nükleaz ücretsiz etanol suda RNase free sulandrarak oluşturulan) ekleyin ve karışımı yavaşça tüp bu birkaç kez tüp kalan tuzu yıkamak için ters çevirme tarafından. Santrifüjü 7 min için yineleyin. İlk P1000 pipet kullanarak çözüm çoğu pipetting tarafından süpernatant kaldırın ve sonra P200 pipet Pelet perturbing olmadan mümkün olduğu kadar çözüm kaldırmak için kullanın. RNA Pelet laminar akış hood veya RNase kirlenmesini önlemek için dikkatli olmak tezgah topaç gibi temiz bir alanda kuru, 15 dakika veya daha fazla sıvı kadar damla tüpe görülebilir. Pelet RNase free su 30 µL içinde resuspend, ürün (örneğin bir spektrofotometre kullanarak) ve aliquot-80 ° C dondurucuda uzun süreli depolama için çözüm ölçmek.Not: Tipik konsantrasyonları 800 – 2500 ng/µL arasında değişir. (İSTEĞE BAĞLI) Üre/sayfa kullanarak tam uzunlukta RNA oluşturulan olduğunu doğrulayın. Alternatif olarak, bir özel jel RNA sağlam olduğunu doğrulamak için kullanın.Not: Ancak, Eğer bir özel jel kullanarak gRNA daha büyük bir miktarda RNA görselleştirmek için çalıştırılması gerekir ve uzunluğu doğru bir şekilde tespit edilemez. Hiç veya çok az kesme mevcut ise hedef reaktifleri enjeksiyon balık içine sonra kesme verimliliğini analiz ederken sgRNA yıkımı için denetlenmelidir. Bir % 8 polyacrylamide jel TBE içinde % 40 polyacrylamide (19:1) ve 8 M üre çözümleri ve ekipman43için RNAse free tekniği kullanarak döküm.Not: Ticari olarak mevcut malzeme ekipman temizlemek için kullanılabilir ( Tablo malzemelerigörmek). Jel (yaklaşık 30 dakika) tamamen katılaşmış sonra jel yanında duvar ilanı equilibrate çalıştığını arabellek ve Elektroforez 5 V/cm 30 dk için performans gösterdiğini TBE içinde. SgRNA 300-500 ng ile eşit bir güç 2 x RNA jel yükleme boya ( Tablo malzemelerigörmek) karışımı. Bir P1000 kullanarak, herhangi bir enkaz kuyu arabellek her şey birkaç kez çalıştıran pipetting tarafından temizleyin. İsn’ta yük ve jel 10 V/cm 2,5 h için çalıştırın.Not: Bir işaretleyici lane burada RNA uzunluğu görselleştirmek yararlıdır ancak gerekli değildir; genellikle kolayca görünür eğer tam RNA olmuştur uzunluğu sentez (Şekil 2). Görselleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) nükleik asit kullanarak bantları leke.Not: bulaşması RNA bozulması (Şekil 2) gösterir, ancak sgRNA bantları tek bir bant görünmelidir. 3. zebra balığı embriyo içine mikroenjeksiyon CRISPR-bileşenleri İstenen kadın ve erkek sayısını yerleştirerek enjekte önce gece tank doğurmak yukarı ayarla (genellikle 2 kadın ve 1 veya 2 erkek) bir bölücü üreme tankla44yerleştirin. % 1.5 özel (bkz. Tablo reçetesi) 1 x E3 medya ile mikroenjeksiyon plaka eritilmiş özel 10 cm Petri kabına içine dökme 35 mL % 0,01 metilen mavisi (mantar ilacı) hazırlayın ve yavaşça kama şeklindeki kaplar içine oluşturmak için bir plastik kalıp yatıyordu çözüm, hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için kalıp dokunarak. Ayarla ve medya küçük bir miktar ile çanak depolamak özel izin ve plaka 4 ° C’de kurumasını önlemek için parafin film sarılıNot: Deforme olmuş ya da Kuru kuyu olmak veya plaka kalıp büyümeye başlar kadar enjeksiyon tabak birkaç hafta için yeniden kullanılabilir. Enjekte sabahı, saf sgRNA ve Cas9 protein buz çözme. Eldivenli RNase kirlenmesini önlemek ve RNase ücretsiz ipuçları ve tüpler kullanmak için tüm malzemeler ele unutmayın. Cas9 protein ve 2:1 oranında son 400 pg/nL Cas9 protein konsantrasyonları elde etmek için Cas9:sgRNA, sgRNA ve 200 pg/nL sgRNA birleştirerek 5 µL enjeksiyon çözüm üretmek. Cas9/sgRNA çözüm Cas9 ve sgRNA bir Ribonükleoprotein karmaşık oluşturmak izin vermek 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. 0.5 µL % 2.5 wt/vol fenol red çözüm ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) ve RNase free su 5 µL son bir hacim için.Not: Cas9/sgRNA karmaşık, bu nedenle KCl ilavesi düşük INDEL oluşumu28sergi sgRNAs kesme verimliliğini artırabilir çözünürlük etkiler çözümün iyonik gücü gösterilmiştir. Bir enjeksiyon iğne 1.0 mm cam çekerek bir micropipette çektirmenin kullanarak kapiller olun. Kolayca koryon ve sarısı sac delip açılı bir açıklık elde etmek için bir yeni jilet veya forseps kullanarak taze yapılmış iğne ucu kesilmiş. Açık hava kaynağı ile bir microinjector bağlı bir micromanipulator iğne yerleştirin. İğne sürekli mineral yağ ile dolu bir petri içine 1 nL çözüm çıkar kadar büyütme belirli cihazları için belirlenen kalibrasyon için uygun kullanarak ışık mikroskobunda enjeksiyon basıncı ayarlayın.Not: İğne kalitesi önemlidir. Bir iğne üreten ve bu beceri bitene embriyo sarısı kesesi içine enjekte pratik deneyler45denemeden önce daha da hakim. Ayırıcıyı kaldırmak ve yaklaşık olarak 15 dakikadır beslemeyi balık sağlar.Not: Uzun yetiştirme süreleri daha fazla embriyo üretecek, enjeksiyon embriyo olasılığını en üst düzeye çıkarmak için 1-hücre aşamada o Cas9 kesme iken ancak tamamlanması gereken erken ve bu nedenle azalma genetik mozaizm gerçekleşir. Embriyolar daha sonraki aşamalarında (2-4 hücre aşamaları) enjekte edilebilir, ancak bu muhtemelen değiştirilmiş alleli germline iletim hızı düşebilir. Bir süzgeç kullanarak yumurta toplamak ve onları içine 10 cm Petri kabına 1 x E3 medya %0,0001 metilen mavisi ile kullanarak durulayın. Sağlık yumurta döllenmemiş yumurta ve enkaz kaldırma ışık mikroskop altında incelemek. 10-15 embriyo uninjected bir denetim olarak ayrı, etiketli Petri kabına koyun. Bir aktarım pipet kullanarak, yavaşça yumurta oda sıcaklığında ısındı enjeksiyon plaka üzerinde sıraya. 1 2.5 X büyütme, diseksiyon mikroskop altında enjekte nL sarısı sac her embriyo içine çözümün toplam 400 pg Cas9 protein ve sgRNA 200 pg enjekte etmek.Not: istediğiniz veya gerekli kesme artırmak için 800 pg/nL Cas9 protein ve sgRNA 400 pg/nL enjeksiyon çözüm için son konsantrasyonu artırmak; Ancak, bu da hedef kapalı kesme artırmak ve/veya embriyo sağlık azaltmak. Kesme verimliliği de doğrudan hücre46enjekte edilerek artırılabilir. Ancak, sarısı çuval içine enjeksiyon Teknik olarak daha az talep ve yüksek germline şanzıman ile balık üretmek için yeterli kesme verir (> % 70 yavru değiştirilmiş bir gen içeren). Enjekte embriyolar için düzgün etiketli bir petri dönmek, onları metilen mavisi ile 1 x E3 medya ile karşılamak ve 28 ° C’ye ayarla bir embriyo kuluçka koydu 24 h fertilizasyon (hpf) sonrası, ölü veya normal olmayan bir şekilde gelişmekte olan bireyler kaldırma enjekte embriyo sağlığını incelemek ve medya (bkz: Şekil 3) değiştirin. Uninjected denetim karşı hayatta kalma oranı kontrol edin.Not: Otelde bir gereksiz gen, daha az % 10 ölümcül hedefleme uninjected denetimi göre bekleniyor. Eğer ölümcül yüksek seviyede uninjected denetimine göre Rehberi-Injected nüfus gözlenir, hedeflenen gen gelişimi için önemlidir veya hedef kapalı efektleri için başarısız geliştirilmesine öncülük gösterebilir. Enjekte CRISPR-reaktifler miktarını azaltarak gerekli olabilir veya azaltılmış hedef kapalı efektleri ile yeni bir sgRNA nesil-ebilmek var olmak gerekli. Embriyolar inkübatör için dönmek ve embriyo için 72 büyümeye devam hpf, embriyo sağlığını korumak için her gün da medyayı değiştirerek. 4. bir HMA kullanarak INDEL oluşumu Verimlilik Analizi Beş embriyoların hpf microcentrifuge tüpler ve toplamak bir içine uninjected bir denetimden set 72 için yetiştirilen enjekte plakalar üzerinden beş embriyo toplamak iki ayarlar. Embriyo %0,004 ekleyerek anestezi MS-222 (tricaine) ve 2 dakika bekleyin. GDNA çıkarmak için yavaşça basına kapalı her embriyo kümesi pipette ve 50 mm NaOH 45 µL ekleyin. Embriyo 95 ° c 10 min için kuluçkaya. Embriyo oda sıcaklığında ısı kaynağı ve serin çıkarın. 1 M Tris-HCl pH 5 µL eklemek 8 ve girdap örnekleri şiddetle = (5-10 lar). Maksimum hızda çözüm santrifüj kapasitesi (> 16.000 x g) Oda sıcaklığında microcentrifuge 3 dakika süreyle süpernatant temiz, etiketli tüp için Transfer ve 6 aya kadar gDNA-20 ° C’de DNA depolamak.Not: DNA parçalarının yaklaşık 900 bp ve daha küçük bu protokolü kullanımı ile oluşturulan. Tahmin edilen kesme makinası kanat önceden tasarlanmış primerler kullanılarak polimeraz ile birlikte gelen belgelere başına 50 µL PCR reaksiyon (uninjected bir denetimi de dahil olmak üzere) her örnekten hazırlanan gDNA 2 µL kullanarak ayarlayın. PCR arındırmak temizlemek bir PCR kullanarak ürün ( Tablo malzemelerigörmek) kiti, su veya elüsyon arabelleği 30 µL örneklerinde elute ve bir spektrofotometre kullanarak DNA ölçmek. Saflaştırılmış her PCR ürününün tüm 30 µL tüpler kaynar su banyosu (yaklaşık 150 mL bir 500 mL ölçek) floatable bir rafa koyarak reanneal. 3 dakika sonra ısı kaynağı açın ve oda sıcaklığında, yaklaşık 1 saat soğumasını çözümleri sağlar.Not: Bu adım ilk DNA denatures ve ipliklerini rastgele mümkün heteroduplex grupları oluşturmak için reanneal izin verir veya polimorfizmleri içeren uyumsuz iki iplikçikli DNA CRISPR-mutagenesis tarafından oluşturulan ve bu nedenle bir değişmiş elektroforetik hareketlilik için homoduplexes karşılaştırıldığında. PCR veya rampa aşağı thermocycler programda son döngüsü ürünleri47,48reanneal için de kullanılabilir, ancak kaynar banyo kullanımı heteroduplex ürünlerin geliştirilmiş çözünürlük verim. 6 yükleme x 5 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) boya reannealed PCR çözümler. % 30 polyacrylamide (29:1) kullanarak bir % 15 polyacrylamide/TBE jel döküm. Jel ayarladığınızda, TBE tampon çalıştıran bir elektroforez cihazı yerleştirin. Bir P1000 kullanarak, herhangi bir enkaz kalan tuzları gibi kuyu temizleyin veya kuyuları yavaşça arabellek yukarı ve aşağı kuyu birkaç kez pipetting tarafından engel parçaları jel. Yük 500 ng reannealed PCR ürünleri ve yük bir denetimin (örnek uninjected balık) her el sgRNA örnekleri yanında. Jel 150 V kadar veya jel alt kısmında boya açık olduğu için 2,5 h çalıştırın. Nükleik asit leke kullanarak bantları görselleştirmek (Örneğin, etidyum bromür veya SYBR yeşil ( Tablo malzemelerigörmek)). Grup desen her kontrol ve CRISPR enjeksiyonlu havuzu embriyo inceleyin.Not: Birden çok görünümünü bantları daha yavaş enjekte içinde çalışan roman heteroduplex ürünleri (Şekil 4) oluşumu karşı uninjected yolları gösterir. Roman heteroduplex DNA varlığını indels CRISPR-enjeksiyon tarafından oluşturulan gösterir. Homoduplex grup yoğunluğu enjekte çözümlerinde azalma yaklaşık % 50 veya daha büyük yeterli germline iletimde neden genellikle yeterlidir. Ayrıca, ilave grup bazen uninjected balıkta tanımlanır ve enjekte balıkta gözlenen heteroduplex bantları düşünülmemelidir. Her hedef için uninjected denetime göre en yüksek kesme verimliliği ile enjeksiyonlar seçin; embriyo bu iğneleri üzerinden balık erken kodon neden indels için bakmak için büyümek için kullanılabilir.Not: yüksek verimli kesme (yaklaşık > yoğunluğu homoduplex grubu azalma), 20-30 yetişkin balık eleme germline iletim elde etmek için yeterli olmalıdır.Daha az kesme oluşturmak sgRNAs için daha fazla yetişkin balık erken kodonu içeren değiştirilmiş gen aktarımını germline sergi balık belirlenmesi olasılığını artırmak için gerekli olabilir. Eğer INDEL oluşumu genin farklı bir bölgeye sgRNA yeniden tasarımı gerekli olabilir görülmektedir değil. Hiçbir heteroduplex band oluşumu gözlenen sgRNA bozulmuş olması ve sgRNA kalite üre/sayfa jel kullanarak doğrulanması gerekir. 5. kimlik ve Knock-out satırları yayılması Bir potansiyel kurucusu üst balık tanımlamak için (indels, olup olmadığını belirlemek için yaklaşık 2.5-3 ay için yetiştirilen) Yetişkin F0 balık kuyruğu klipleri gerçekleştirin. 0,62 mM tricaine balıkta anestezi (bkz. Tablo malzemeler), daha sonra yaklaşık 1/2-3/4 / kuyruk yüzgeci kaldırmak için temiz, keskin jilet kullanın. 50 mM NaOH 45 µL içinde kuyruk yerleştirin ve bir kurtarma tank balık dönmek. GDNA ayıklama açıklanan (adım 4.2-4.4) olarak gerçekleştirin. Bir kez balık normal yüzme davranış devam eder, balık geri akan yer kadar INDEL doğası tanımlanmış sistem su.Not: Bireysel balık tanınır ve kuyruk klipleri sonuçlarına uygun şekilde eşleştirilir emin olmak için önemlidir. Açıklandığı gibi (adımları 4.5-4,9), balık CRISPR enjeksiyon (Şekil 5) tarafından güncellenmiştir belirlemek için kuyruk klip gDNA üzerinde bir HMA gerçekleştirmek. Kurucusu balık tanımlamak için vahşi tipli balık kuyruğu gDNA heteroduplex Grup Sergi yetişkin doğurmak. Embriyo toplamak ve onları 72 için büyümek hpf. 72, hpf, 10 embriyo toplamak ve her embriyo bir bireysel tüpü yerleştirin. 50 mm NaOH 11,25 µL ve 1 M Tris pH 1,25 µL kullanarak bir gDNA çıkarma (adımları 4.2-4.4) yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirmek = 8. INDEL allelleri bu nesil (Şekil 6) geçirilmiştir Eğer belirlemek için PCR ve Elektroforez (yukarıdaki adımları 4.7-4.13) açıklandığı gibi heteroduplex Grup tanımlamak için yineleyin. HMA kullanarak tek embriyo gözlenen yüzde iletim dayanarak, ortalama 20-30 embriyolar her CRISPR satırları yetişkinlik ilgilendikleri için cross tarafından elde büyümek.Not: Bu sayının artırılması veya azaltılması germline iletim Frekansa bağlı olarak. İndels varlığı olarak açıklanan (adım 5.1-5,2) tanımlamak için yetişkin F1 balık kuyruğu klipleri gerçekleştirin. Açıklandığı gibi (adımları 4.5-4,11), gerçekleştirmek bir HMA balık bir INDEL (Şekil 7) taşıyan belirlemek için kuyruk klip gDNA. Heteroduplex grubu içeren Balık DNA sıralama analiz için hazır olun. Kesme sitenin etrafında merkezli bir 300-600 bp PCR ürünü yükseltmek için yeni primerler kullanılarak PCR gerçekleştirin. Kullanım bir PCR arıtma kiti DNA’temizleyip 30 µL. elute tek bir bant mevcut olduğundan emin olmak için DNA bir özel jel üzerinde inceleyin.Not: Bazı heteroduplex bantlama üzerinde özel jel mevcut olabilir ve bir küçük smear veya beklenen boyutu PCR ürünü hemen üstünde çift kişilik grup olarak görünür. 1-3 indels analiz edilir, PCR ürünleri Sanger kullanarak sıra sıralama ve Biyoinformatik aracı49kullanarak INDEL sırasını belirlemek. Aksi takdirde, NGS analizi kullanılarak birden çok PCR ürünü dizisi belirlenmesi (bakınız Tablo reçetesi) daha ekonomik. Biyoinformatik aracını kullanarak sıra analiz ederek erken kodonu elde Eğer belirlemek ( Tablo malzemelerigörmek). Uygun etiketleri ile yeni bir tank içine istenilen mutant gen içeren balık yer. PCR astar için belirli INDEL allelleri gelecekteki Genotipleme ihtiyaçları için tasarım. Bu astar mutasyona uğramış sıra yayılan ve vahşi-tipi kol yükseltmek değil. % 25 knock-out satırlarını içerecek bir yavru nüfus oluşturmak için çapraz Heterozigoz zebra balığı.

Representative Results

Bu protokol için açıklanan deneysel yaklaşımlar zebra balığı knock-out satırları CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanarak verimli, düşük maliyetli üretim için izin. Aşağıdaki şekiller yorumu ve bu iletişim kuralını kullanan elde edilen sonuçları sorun giderme kolaylaştırmak için bu makalede dahil edilmiştir. Başarılı bir üretim ve CRISPR-reaktifler mikroenjeksiyon, zebra balığı embriyo aleni fenotipleri ve HMA kullanarak INDEL oluşumu için analiz edilebilir. CRISPR-deney başarısı görselleştirmek için yardımcı bir denetim içinde adım 1.5-pigment üreten gen hedeflemek için açıklanan sgRNA kullanmaktır tirozinaz. Cas9 kaynaklı INDEL oluşumu tirozinaz , pigmentasyon kaybına neden olur ve 48 tarafından kolayca attı hpf (Şekil 1). CRISPR-reaktifleri o hazırlanması için enjeksiyon başarılı oldu sağlamak için başka bir yararlı olduğu bu tam uzunlukta doğrulamak için (120 nt) sgRNA sentez bir denaturing polyacrylamide jel (Şekil 2, Lane 1 ve 2) kullanarak. RNA bozulmuş o görünür bir smear örneğin enjeksiyon için uygun değildir bozulmuş RNA Lane 3 (resim 2) gösterir. Tirozinaz, gibi açık fenotipleri neden değil CRISPR-Cas9 tarafından hedef genlerin INDEL oluşumu sıklığı çözümlenecek HMA bir basit ve güvenilir yöntem analizidir. sgRNA/Cas9 heteroduplex Grup oluşumu ve homoduplex grubu (Şekil 4) yoğunluğunu azalması HMA sonuçları kullanılarak analiz embriyo enjekte. Heteroduplex bant varlığı daha fazla potansiyel kurucusu balık microinjected embriyo aldı ve bir kurucu ( germline iletim verimliliğini analiz etmek için yetişkin (Şekil 4 ve Şekil 5), belirlemek için bu iletişim kurallarını kullanılmaktadır Şekil 6) ve bir INDEL Heterozigoz F1 balık (Şekil 7) varlığını doğrulamak için. Bir INDEL içeren Heterozigoz balık NGS INDEL doğasını belirlemek için ve erken kodonu hedef genin kodlama bölgede mevcut olup olmadığını belirlemek için adaylarıdır. Resim 1 : Zebra balığı embriyo bir sgRNA tek hücreli aşamada tirozinaz hedefleme ile enjekte edildiğinde bir pigment kusur sergi. (A)vahşi-türü, uninjected embriyo 48 hpf ve (B) enjekte embriyo 48 hpf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : SgRNA sentez seti kullanarak, vitro transkripsiyonu. Oligos vitro transkripsiyon sgRNA sentez kiti talimatlara göre kullanarak sentez. 500 ng RNA’ın açıklandığı gibi bir üre/sayfa jel üzerinde çalıştırmak. 1 ve 2 şerit yüklü sgRNA tam uzunlukta, bozulmadan 120 nt RNA karşılık gelen bir grup gösterir. Şeritte 3 sgRNA enjeksiyon için uygun değildir bozulmuş bir RNA örnek gösterir. Şekil 3 : 24 enjekte hpf embriyo sağlık karşılaştırılması. Bir yaşam embriyo(a)geliştirilen 24-hpf, geliştirme (B) iptal edildi bir embriyo kolayca ayırt. (B) benzer veya büyük ölçüde olan embriyo gibi omurilik eğriliği (a), özellikleri değiştirmiş veya değiştirebileceği kafa ve göz geliştirme yemek kaldırılmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : SgRNA-Cas9 Heteroduplex hareketlilik tahlil microinjected zebra balığı embriyolar. Örnek başına 5 embriyo takımlık 72 toplanan hpf ve gDNA elde. Heteroduplex çözümlemenin açıklandığı gibi örnekleri eşit 500 ile doluydu ng DNA’ın. Şerit: M = 100 bp işaret; 1 = uninjected denetimi; 2 = enjeksiyon örnek 1; 3 = enjeksiyon örnek 2. Beklenen Grup boyutu = 98 bp. Şekil 5 : Heteroduplex hareketlilik tahlil yetişkin CRISPR enjeksiyonlu zebra balığı kuyruk çıkarılan gDNA. Bir sgRNA ve Cas9 protein enjekte edildi embriyo yetişkinliğe (3 ay) yetiştirilmiştir. Balık B ve C heteroduplex Grup Sergi ve daha sonra iletilen germline indels tanımlamak için bred; bir pozitif heteroduplex grup göstermez çünkü Balık A daha sonraki analiz alışık değildi. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık A; = 3 balık B; = 4 = balık C. beklenen Grup boyutu = 98 bp. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6 : Heteroduplex hareketlilik tahlil F0 CRISPR enjeksiyonlu zebra balığı aktarılan germline indels tanımlamak için bir vahşi tipli balık yetiştiriciliği tarafından oluşturulan tek embriyo. Zebra balığı çiftleş ve 72 h. tek embriyo için yetiştirilen F1 embriyo toplanmıştır ve heteroduplex çözümleme açıklandığı gibi yapılır. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2-10 lane başına tek bir F1 embriyo =. Bu jel 7 dışarı-in 10 embriyo INDEL % 70’i germline iletim hızıyla belirten bir pozitif heteroduplex grup show gösterir. Beklenen Grup boyutu = 98 bp. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 7 : Heteroduplex hareketlilik tahlil yetişkin F1 zebra balığı kuyruk klip. Yetişkin F1 balık indels tanımlamak için HMA tarafından skorlanmıştır. Bir pozitif heteroduplex grup sergilenen balık mutasyon doğasını belirlemek için güçlendirilmiş ve geniş sıralama analiz için gönderilen PCR vardı. (A)şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık (4 bp silme, 1 bp uyuşmazlığı) =. (B) bu F1 balık aynı kurucusu tespit edilmiştir ve henüz desenlendirme, tek bir kurucusu birden çok değiştirilmiş gen aktarımını germline gösteren farklı heteroduplex göster. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık (4 bp ekleme, 7 bp uyuşmazlığı), B = 3 balık C (4 bp silme, 4 bp uyuşmazlığı) =. Her biri bu indels NGS tarafından belirlenen hedef gen kodlama dizisi içinde erken kodonu oluşturdu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu iletişim kuralı gen knockouts üretim CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı omurgalı modeli sistemde açıklar. Bir dizi protokolü daha önce zebra balığı15,25,26,50,51,52CRISPR-aracılı genom mühendislik taahhüt tarif edilmiştir. Bu iletişim kuralı önceki çabaları bir takım basit ama tekrarlanarak tutarlı Deneysel teknikler, özellikle bir araya getirerek HMA ve NGS birden çok basit, ekonomik, oluşturmak için Heterozigoz balık ve deneysel olarak sağlam iletişim kuralı oluşturur CRISPR-aracılı ile personel eğitim ve deneyim yanı sıra labs öğretim yelpazesi ile personel labs için uygundur zebra balığı içinde mutagenesis için.

Tasarım ve RNA’ların bu protokol için dahil edilen Kılavuzu sentezi için öneriler. Bir büyük RNA tasarım kılavuzundaki hedef kapalı etkileri indirilmesi noktadır. CRISPR-kullanıcıların hem hedef üzerinde Kılavuzu etkinlik ve hedef kapalı etkileri34, olasılığını tahmin Kullanıcı dostu grafik arayüze sahip hesaplama araçları erişmesine izin vermek için çeşitli tahmin algoritmalar geliştirilmiştir 35,36. Zebra balığı sistemin belirli bir avantajı hedef kapalı etkileri indirdi oranları Cas9 embriyo enjekte edilir ve bu nedenle ifade hangi farelerde azalmış hedef kapalı etkileri53neden olarak gösterilen geçicidir, çünkü. Bununla birlikte, hedef kapalı etkileri zebra balığı54yılında gerçekleşmesi için gösterilmiştir. Bir denetim için hedef sonuç için bu kılavuzların farklı hedef kapalı sitelerini etkileyen büyük olasılıkla olacak gibi bu aynı gen hedefleyen iki bağımsız Kılavuzu RNA’ların tarafından oluşturulan fenotip kurucusu zebra balığı için yoludur. Bu iletişim kuralında tanımlanan hedef kapalı etkileri en aza indirmek için alternatif bir yöntem olan yüksek verimlilik ile tamir tek kırılmalara DNA, target oluşturur bir mutasyona uğramış Cas9 kullanmaktır. Tersi tamamlayıcı DNA nickler birbirine yakınlığı içinde eşleştirme istenen odağı, etkili INDEL oluşumunda sonuçları ayrılmaktadır ve hedef kapalı etkileri55,56en aza indirir.

Hedef kapalı etkileri farklı oranlarda sahip olmanın yanı sıra, farklı sgRNAs mutagenesis istenen hedef57,58,59farklı oranlarda olabilir. Bu protokol heteroduplex band oluşumu33,40kullanarak belirli bir sgRNA mutagenesis verimliliğini analiz etmek HMA kullanır. Heteroduplex grupları ve uyuşmazlıkları içeren jel elektroforez kullanılarak kolayca çözülebilir PCR tarafından oluşturulan DNA iplikçiklerinin hibridizasyon tarafından oluşturulur. INDEL oluşumu ölçmek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemlerin aksine T7 endonükleaz gibi tahlil veya yüksek çözünürlüklü eritmek analiz25,26, HMA eşleşmeyen DNA kesmek için pahalı bir enzim does değil istemek ve does değil istemek karmaşık analizini PCR eğrileri eritebilir. Önemlisi, HMA INDEL oluşumu enjekte nüfus yüksek oranda doğrulamak için kullanmak da bir mutasyon ile belirlenmesi maliyetini azaltan sonraki knock-out satırları, üretim için gerekli balık sayısını en aza indirmek için Dedektif, sağlar istenen özellikleri.

CRISPR tabanlı indels üreten göreli kolaylığı aynı anda birden çok gen birden çok gen oluşturulmasını sağlar. Web tabanlı yazılım, heterozigoz balık Sanger kullanarak tek mutasyon analizi için kullanılabilir PCR ürünleri49sıralama. Nerede üç veya daha fazla CRISPR mutasyona uğramış gen analiz edilir, NGS INDEL doğası karakterize etmek için büyük olasılıkla daha bu yaklaşım olarak INDEL doğası karakterize etmek için uygun maliyetli olmak o karakterize edilebilir için en çok 50 farklı gen havuzu sağlar durum nce (bakınız Tablo reçetesi)60,61,62. Böyle ölçek ekonomisi büyük olasılıkla bir lisans laboratuvar ortamında özellikle yararlı olacaktır.

Özet olarak, bu iletişim kuralı daha az yetişkin balık oluşturulabilir ve başarılı bir şekilde ilgi, mutant gen belirlemek için çözümlenebilir gerekir öyle ki tekrarlanarak yüksek kalitede CRISPR-reaktifler (özellikle sgRNA) oluşturmak için adım adım yönergeler sağlar hangi Ayrıca zaman ve istenen satırlar maliyetini azaltır. Önemlisi, bu iletişim kuralı mutant zebra balığı uygun bir şekilde üretmek için sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar tarafından uygulanabilir öyle ki tasarlanmıştır. Ayrıca, biz bulduk bu yaklaşım lisans öğrencileri için uygundur ve böylece eğitim ve öğretim lisans öğrencilerinin uygulamalı deneyim genom CRISPR tabanlı düzenleme ilgi için fırsatları genişletir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (R21CA182197) için Albay Ralph W. ve Grace M. Douchez araştırma güven, Purdue tarım bilim ve ekonomik kalkınma (AgSEED) programı için uzantısı tarafından. Sanger sıralama veri P30 CA023168 tarafından desteklenen Purdue genomik çekirdek tesis tarafından satın alınan. Mary Witucki Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından Carroll bölgesi Kanser Derneği tarafından desteklenen kanser araştırma yaz lisans araştırma programı için destek verdi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. Biz Benjamin Carter, Ellen Denning ve Taylor Sabato el yazması üzerinde kritik geribildirim sağlamak için teşekkür ederiz. Biyokimya Bölümü için destek bu çalışmanın ve onların bağlılığı bakım ve zebra balığı kolonimiz refahı için Purdue Üniversitesi’nde zebra balığı araştırma merkezi teşekkür ederiz. Son olarak, Purdue genomik çekirdek tesisin teşekkür ediyoruz ve Phillip San Miguel katkılarıyla NGS Hizmetleri ile ilgili.

Materials

CRISPOR sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/
Breaking-Cas sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChop sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3 PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free technique http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free water Any brand Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.
Rnase-free ethanol Any brand Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.
Cas9 Protein PNA Bio CP01 Cas9 protein with nuclear localization signal.
Target specific oligos Integrated DNA Technologies (IDT) Synthesize guide RNAs.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.
EnGen sgRNA Synthesis Kit New England BioLabs E3322 In vitro transccribe guide RNAs.
10X TBE Thermo Fisher B52 RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.
6X Load Dye New England BioLabs B7025S Loading DNA for electropheresis.
5M Ammonium acetate Thermo Fisher AM9071 Clean up reagent for purification of guide RNAs.
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any brand Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.
Nuclease-free Water Any brand For synthesis and purification of guide RNAs.
RNase away Thermo Fisher 10328011 Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.
DNA Ladder, 100 bp New England BioLabs N0467S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
DNA Ladder, 1 kb New England BioLabs N0552S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
RNA Ladder New England BioLabs N0364S Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized
TEMED Thermo Fisher 17919 Casting polyacrylamide gel.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Casting polyacrylamide gel.
40% Polyacrylamide (19:1) BioRad 161-0154 Casting denaturing polyacrylamide gel.
Urea Sigma-Aldrich U5378-100G Casting denaturing polyacrylamide gel.
RNA Gel Loading Dye (2x) Thermo Fisher R0641 Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510-10ML Visualization of nucleic acids.
SYBER Green Thermo Fisher S7563 Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.
Microcentrifuge Eppendorf 5424 RNA clean up, PCR purification.
MyTaq Polymerase Bioline BIO-21105 For amplification of DNA using PCR.
Thermocycler Any brand PCR amplification.
Spectrophotometer Any brand NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.
E3 embryo media Made in house Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140 Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish Thermo Fisher FB0875711Z Store embryos, cast injection plate.
Agarose Denville CA3510-8 Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold Adaptive Science Tools TU-1 To create wells to hold embryos during injection.
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290  Dye for visualization of injection.
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5904-5ML To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes Any brand Moving embryos.
Razor blade Thermo Fisher 11295-10 Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator Any brand Maintaining embryos at 28.5 oC.
Verticle pipette puller David Kopf Instruments 700C Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes Sutter Instruments BF100-58-10 Geneate needles for injection.
Microloader tips Eppendorf 930001007 Load solution into injection needles.
Microinjector World Precision Instruments PV 820 Injecting embryos.
Disecting microscope Leica Injecting embryos.
30% Polyacylamide (29:1) BioRad 161-0156 Heteroduplex gel casting.
MS-222 (Tricaine) Sigma-Aldrich A-5040 Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Microwave Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Scale Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Gloves Any brand For all aspects of the protocol.
N2 Any brand To expell liquid from the capillary for embryo injection.
1,000 µL  tips Any brand For all aspects of the protocol.
200 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
10 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
PCR strip tubes Any brand For all aspects of the protocol.
Micropipettes Any brand For all aspects of the protocol.
NGS Sequencing platform: Wideseq If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).
Software for sequence analysis For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software for sequence analysis SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
  3. Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
  4. Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  5. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
  6. Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061 (2013).
  7. Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process?. PLoS Genet. 10 (1), e1004086 (2014).
  8. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  10. Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
  11. Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
  12. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
  13. Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
  14. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141 (2013).
  15. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
  18. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  19. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  20. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  21. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  22. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  23. Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
  24. Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547 (2016).
  25. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282 (2014).
  26. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  27. Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
  28. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
  29. Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
  30. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555 (2016).
  31. Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
  32. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186 (2014).
  33. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  34. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  35. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
  36. Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
  37. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  38. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  39. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  40. Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
  41. Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
  42. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319 (2015).
  43. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
  44. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  45. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  46. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
  47. Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
  48. Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
  49. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  50. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  51. Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
  52. Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
  53. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
  54. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  55. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  56. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  57. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  58. Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
  59. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
  60. Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002 (2014).
  61. Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
  62. Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).

Tags

CRISPR/Cas9Gene KnockoutDanio RerioZebrafishTargeted Genome EditingIn Vitro TranscriptionSgRNAAmmonium Acetate PrecipitationEthanol PrecipitationRNA Purification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. J. Vis. Exp. (138), e56969, doi:10.3791/56969 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image