Изменения в системе модель данио рерио (данио рерио) целевых генома значительно способствовало появление подходов на основе ТРИФОСФАТЫ. Здесь мы описываем обтекаемый, надежный протокол для поколения и идентификации ТРИФОСФАТЫ производные нонсенс аллели, включающий гетеродуплексного assay мобильности и выявление мутаций, с помощью следующего поколения последовательности.
Характеристика кластеризованный, регулярно interspaced, короткие, рецидивирующий repeat (ТРИФОСФАТЫ) система Streptococcus pyogenes позволила настраиваемый платформы быстро генерировать генной модификации в широкий спектр организмов, в том числе данио рерио. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования использует один руководство РНК (sgRNA) для целевой эндонуклеазы связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) в геномной ДНК (геномная ДНК) целевой интерес, где Cas эндонуклеазы генерирует двухручьевой перерыв (DSB). Ремонт DSBs ошибкам механизмов привело к вставок и удалений (indels). Это может привести к фреймшифт мутации, которые часто вводят кодоном преждевременной остановки в пределах последовательности кодирования, таким образом создавая аллеля белка null. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома инжиниринг требует лишь несколько молекулярные компоненты и легко вводится в zebrafish эмбриона путем микроинъекции. Этот протокол описывает методы, используемые для создания ТРИФОСФАТЫ реагенты для данио рерио микроинъекции и для идентификации рыб, экспонируется микрофлорой передачи ТРИФОСФАТЫ изменение генов. Эти методы включают в себя в vitro транскрипция sgRNAs, микроинъекции ТРИФОСФАТЫ реагентов, выявление indels индуцированных на целевой сайт, используя метод, основанный на ПЦР, называемое гетеродуплексного мобильности пробирного (HMA) и характеристика indels с помощью низкую пропускную способность и мощный следующего поколения последовательности (НГС)-на основе подхода, который можно анализировать несколько продуктов ПЦР, собранных от гетерозиготных рыбы. Этот протокол является упорядочена, чтобы свести к минимуму количество необходимых рыбы и видов оборудования, необходимых для выполнения анализа. Кроме того этот протокол предназначен для подпадать для использования в лаборатории личного всех уровней опыта, включая магистрантов, позволяя этот мощный инструмент для экономически использоваться любой исследовательской группой заинтересованных в выполнении основанный ТРИФОСФАТЫ геномных изменений в данио рерио.
Сохранению молекулярного механизма через эукариот лежит сила с использованием модельных организмов для исследований. Многие из этих систем модели облегчить использование реверс генетических подходов, таких как целевых генов нокауты охарактеризовать вклад продукт гена биологического или болезнь процесс интерес. Джин нарушение методов в организмов, таких как данио рерио исторически полагались на целевых введение фреймшифт мутации, которые обусловлены неточным ремонт DSBs1,2. Когда DSB вводится в геноме, поражения ДНК будет восстановлена через один из двух путей, которые повсеместно присутствуют почти все типы клеток и организмов: не гомологичных конце присоединения (NHEJ) и ориентированные на гомологии ремонт (HDR)3,4 . Неточный характер NHEJ машины часто производит indels различных длин5,6,,78,9. Введение фреймшифт перегласовок в кодирующая последовательность гена может производить преждевременной остановки кодоном, который часто оказывает ген нефункциональным.
Инженерной стратегии раннего генома в zebrafish содействовать indels включены meganucleases, цинка палец nucleases и транскрипции эффекторных активатор как nucleases, все из которых использовали ДНК белковых взаимодействий целевой нуклеиназы к определенному геномной Целевой объект, где он представил14,13,11,12,15, DSB10,. Однако эти технологии часто трудно применять благодаря трудоемким и сложным техники, необходимые для создания Нуклеаза, предназначенный для последовательности ДНК интерес. В отличие от предыдущих стратегий основанный ТРИФОСФАТЫ гена редактирования не полагаться на ДНК белковых взаимодействий для ориентации. Вместо этого связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) эндонуклеазы направлена через РНК руководство, которое использует базовый сопряжения взаимодействий нуклеотидов для целевой геномной сайт интерес16,,1718,19 ,,2021. Благодаря простоте разработки РНК руководство с желаемой спаривание взаимодействий для ориентации его относительно легко ориентироваться эндонуклеазы Cas для желаемого Локус. Тип II ТРИФОСФАТЫ системы в частности широко разработан для редактирования генома приложений благодаря несколько выгодных функций, включая использование единого многодоменных Cas нуклеиназы (Cas9), требующего взаимодействия с ДНК для стимулирования активности эндонуклеазы и использования единого руководства РНК (sgRNA) для его родственных последовательности ДНК18. Последовательность требования, необходимые для нападения на родственных sgRNA, хорошо понимали19, и желаемый sgRNA легко порожденных в vitro транскрипция. Простота и надежность ТРИФОСФАТЫ/Cas9 подход значительно облегчает целевых генетической модификации в данио рерио и широкий спектр других организмов.
Укрепление способности осуществлять что изменения целевых генома в zebrafish вследствие разработки основанный ТРИФОСФАТЫ реагентов значительно увеличить возможность изучать процессы символических позвоночных организмов, таких как развитие центральной нервной системы. Данио рерио геном содержит Ортологи 70% белка кодирование генов в геном человека, а также 84% генов, связанных с заболеваниями в людях22. Данио рерио развития экспонатов несколько ключевых качеств, которые повышают его использования в обратном генетические исследования: эмбрионы закладываются в больших лап, развивать внешне от матери, что делает их поддается генетической манипуляции, микроинъекции и взрослых рыбок данио сексуально зрелых, 3 месяцев, что позволяет для быстрого распространения желаемых линий23.
Доступны многочисленные протоколы, описывающие различные подходы для создания и определения ТРИФОСФАТЫ производные indels в zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Однако многие из этих процедур являются время интенсивного, требуется доступ к дорогостоящим оборудованием и может быть сложным для лабораторий с ограниченным опытом. Шаги, описываемые обеспечивают простой, надежный и экономичный ТРИФОСФАТЫ/Cas9-стратегию инженер данио рерио нокаут линий. Этот протокол описывает использование высокоэффективных комплект синтезировать sgRNAs с помощью ДНК-олигонуклеотиды (oligos), похож на другие подходы, которые были ранее описанных32. Описывается протокол включает два шага, в частности, значительно упростить анализ мутировал ТРИФОСФАТЫ линий: поэтапное использование на основе ПЦР HMA33 легко определить присутствие модификаций генома и анализ последовательности у гетерозиготных мышей данио рерио быстро и легко определить характер несколько indels экономичным образом. Кроме того пошаговые инструкции включены для надежный выбор, надежный добывающих и нагнетательных руководство РНК. Шаги, описанные здесь олицетворяют сравнительно недорогой, надежный протокол, позволяющий лабораторного персонала с широкий спектр опыта вносить идентификации генов нокауты в данио рерио.
Этот протокол описывает производства гена нокауты в системе позвоночных модель данио рерио, с использованием технологии ТРИФОСФАТЫ-Cas9. Ранее были описаны ряд протоколов для проведения инженерных ТРИФОСФАТЫ опосредованной генома в zebrafish15,25,26,50,,51–52. Этот протокол основывается на предыдущих усилий, объединения ряд простых, но можно воспроизвести последовательную экспериментальные методы, в частности, HMA и NGS несколько гетерозиготных рыбы, чтобы создать простой, экономичный, и экспериментально надежный протокол для ТРИФОСФАТЫ опосредованной мутагенеза в данио рерио, который подходит для лабораторий укомплектованы персоналом с широкий спектр профессиональной подготовки и опыта, а также учебных лабораторий.
Рекомендации по конструкции и синтез руководство РНК, включены в этот протокол. Основное внимание в руководстве РНК дизайн является минимизация эффектов пробить. Были разработаны несколько алгоритмы предсказания позволяет ТРИФОСФАТЫ пользователям доступ к инструментам вычисления с удобный графический интерфейс, которые предсказывают как деятельность на цели руководства и шанс пробить эффекты34, 35,36. Конкретные преимуществом системы данио рерио является снижение ставки-целевого воздействия, потому что Cas9 вводят в эмбрионы, и поэтому выражение является несохраняемым, которое было показано в мышах приведет к снижению пробить эффекты53. Тем не менее было продемонстрировано пробить эффекты встречаются в zebrafish54. Один из способов управления для пробить эффектов является основатель фенотип данио рерио, что были получены два независимых руководство РНК, которые нацелены же ген, как эти руководства будут скорее всего, влияет на различных сайтах-целевого. Альтернативный способ свести к минимуму последствия мимо, не описанное в настоящем Протоколе является использование мутировавших Cas9, который генерирует однорядная перерывы на цель ДНК, которые устраняются с высокой эффективностью. Сопряжения ДНК Никс в непосредственной близости друг от друга, которые являются дополнительными к противоположной нити результатов в формировании эффективного indel в желаемой локусе и минимизирует пробить эффектов55,56.
Помимо различных ставок-целевого воздействия, различные sgRNAs может иметь различные ставки мутагенеза желаемому57,,5859. Этот протокол использует HMA для анализа эффективности мутагенеза данного sgRNA с использованием гетеродуплексного группы формирования33,40. Гетеродуплексного полосы создаются путем гибридизации генерируемые ПЦР ДНК пряди, которые содержат несоответствия и может быть легко решена с помощью электрофореза геля. В отличие от других методов, обычно используется для измерения indel формирования такие как T7 эндонуклеазы пробирного или высоким разрешением расплава анализ25,26, HMA не требуют дорогих фермента сократить несоответствие ДНК и не требует сложный анализ ПЦР расплава кривых. Важно отметить, что использование HMA проверить высокие темпы indel формирования в вводят население также позволяет следователю свести к минимуму количество рыбы, необходимые для последующего производства нокаут-линий, что снижает стоимость выявления мутации с желательными характеристиками.
Относительная простота генерации основанный ТРИФОСФАТЫ indels позволяет создавать несколько аллелей генов, несколько сразу. Веб-программное обеспечение для анализа одной мутации от гетерозиготных рыбы с использованием Сэнгер последовательности продуктов ПЦР49. В случае, когда анализируются три или более аллелей ТРИФОСФАТЫ мутировал NGS характеризовать характер indel, скорее всего, чтобы быть более экономически эффективным, чтобы характеризовать характер indel как этот подход позволяет бассейн до 50 различных аллелей характеризуется на o NCE (см. Таблицу материалы)60,,6162. Такая экономика масштаба, вероятно, будет особенно полезным в бакалавриат лабораторных условиях.
Таким образом, этот протокол предоставляет пошаговые инструкции для герметизации генерации высокого качества ТРИФОСФАТЫ реагентов (в частности, sgRNA) таким образом, что меньше взрослых рыб должны быть созданы и проанализирована успешно определить мутантные аллели интереса, который также снижает время и стоимость генерации требуемой линии. Важно отметить, что этот протокол был разработан таким образом, что он может быть применен в лабораториях с ограниченными ресурсами для производства zebrafish мутант доступным образом. Кроме того мы нашли, что этот подход подходит для магистрантов и таким образом расширяет возможности для образования и профессиональной подготовки студентов, заинтересованных в практический опыт в основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R21CA182197 J.O.), Ральф W. и Грейс м. Шолвальтер исследование доверия и в Purdue сельскохозяйственной науки и расширение для программы экономического развития (AgSEED). Сэнгер последовательности данных были приобретены Purdue Genomics Core, поддерживаемый Р30 CA023168. Мэри Witucki поддержали центр Университета Purdue рака исследований летних студентов исследовательской программы при поддержке Ассоциации округа рака Кэрролл. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Мы благодарим Бенджамин Картер, Эллен Деннинг и Тейлор Sabato за предоставление критических отзывов на рукопись. Мы благодарим Департамент биохимии за поддержку этой работы и центр данио рерио исследований в университете Purdue, за их самоотверженность в уходе и благосостояние наших данио рерио колонии. Наконец мы благодарим объекта Core геномики Purdue, и вклад Филлип-Сан-Мигель в отношении услуг NGS.
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |