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Genetics

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Published: August 28, 2018
doi:
10.3791/56969
, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University

Summary

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Abstract

Caracterização do cluster, regularmente intercaladas, curto, palíndromo repetir sistema (CRISPR) de Streptococcus pyogenes permitiu o desenvolvimento de uma plataforma personalizável para gerar rapidamente as modificações do gene em uma ampla variedade de organismos, incluindo o zebrafish. Edição baseada em CRISPR genoma usa um guia único RNA (sgRNA) para atingir uma endonuclease CRISPR-associado (Cas) para um destino de DNA (gDNA) genômico de interesse, onde a endonuclease Cas gera uma ruptura da dobro-Costa (DSB). Reparação de DSBs por chumbo mecanismos propenso para inserções e/ou exclusões (puntuais). Isso pode causar mutações frameshift que frequentemente introduzir um códon de parada prematuro dentro da sequência de codificação, criando assim um alelo de proteína-nulo. Baseado em CRISPR genoma engenharia requer apenas alguns componentes moleculares e é facilmente introduzida zebrafish embriões por microinjeção. Este protocolo descreve os métodos usados para gerar os reagentes CRISPR para microinjeção de zebrafish e identificar peixes exibindo germline transmissão de genes CRISPR-modificado. Estes métodos incluem transcrição in vitro de sgRNAs, microinjeção de reagentes CRISPR, identificação de puntuais induzida no local de destino usando um método baseado em PCR, chamado um ensaio de mobilidade doheteroduplex (HMA) e caracterização do puntuais usando uma taxa de transferência baixa e um poderoso sequenciamento de próxima geração (NGS)-com base em abordagem que pode analisar múltiplos produtos PCR coletados de peixes heterozigotos. Este protocolo é aerodinâmico para minimizar o número de peixes necessários e os tipos de equipamentos necessários para realizar as análises. Além disso, este protocolo é projetado para ser favorável para utilização pelo pessoal do laboratório de todos os níveis de experiência, incluindo alunos de graduação, permitindo que esta poderosa ferramenta ser empregado economicamente por qualquer grupo de pesquisa interessado em executar baseado em CRISPR modificação de genômica no zebrafish.

Introduction

A conservação de máquinas moleculares em eucariontes subjaz o poder do uso de organismos modelo para pesquisa. Muitos destes sistemas modelo facilitam a utilização de abordagens reverso-genética como nocautes alvejado do gene para caracterizar a contribuição de um produto do gene de um processo biológico ou doença de interesse. Técnicas de perturbação genética em organismos como o zebrafish historicamente têm confiado na introdução alvo de mutações frameshift resultantes da reparação imprecisa de DSBs1,2. Quando um ORL é introduzido no genoma, a lesão de DNA é reparada através de um dos dois caminhos que estão universalmente presentes em quase todos os tipos de células e organismos: não-homóloga final juntando (NHEJ) e reparação de homologia-dirigido (HDR)3,4 . A natureza imprecisa da maquinaria NHEJ frequentemente produz puntuais de vários comprimentos5,6,7,8,9. Introdução de mutações frameshift, na sequência de codificação de um gene pode produzir um codão stop prematuro, que muitas vezes torna o gene não-funcionais.

Primeiras estratégias de engenharia do genoma no zebrafish para promover puntuais incluíam meganucleases, nucleases de zinco-dedo e nucleases de ativador, como efetoras transcrição, os quais utilizaram interações DNA-proteína para direcionar uma nuclease para um determinado genoma destino onde introduziu um ORL10,11,12,13,14,15. No entanto, essas tecnologias são muitas vezes difíceis de aplicar devido a trabalhosa e complexa engenharia necessária para gerar uma nuclease que tem como alvo a sequência de DNA de interesse. Ao contrário de estratégias anteriores, baseadas em CRISPR gene edição não depende de interações proteína-ADN para o direcionamento. Em vez disso, a endonuclease CRISPR-associado (Cas) é direcionado por meio de um guia de RNA que usa base de interações de emparelhamento de nucleotídeos para direcionar um site genômico de interesse16,17,18,19 ,20,21. Devido à simplicidade de projetar um RNA guia com a base desejada emparelhamento interações para o direcionamento é relativamente fácil de direcionar a endonuclease de Cas para o local desejado. O tipo II CRISPR sistema em particular foi amplamente desenvolvido para aplicações de edição de genoma devido a várias características vantajosas, incluindo o uso de um único vários domínios Cas nuclease (Cas9) que requer a interação com o DNA de estimular a atividade endonuclease e uso de um único guia do RNA (sgRNA) para destiná-las para o cognato de sequência de DNA18. Os requisitos de sequência necessários para o direcionamento do cognato sgRNA são bem compreendido,19, e o sgRNA desejado é facilmente gerado pela transcrição em vitro . A simplicidade e robustez da abordagem CRISPR/Cas9 facilita grandemente a modificação genética direcionada no zebrafish e uma grande variedade de outros organismos.

A capacidade avançada de empreender genoma alvo edição no zebrafish como resultado de desenvolvimento baseado em CRISPR reagentes tem significativamente aumentado a oportunidade de estudar processos emblemáticos de organismos vertebrados tais como desenvolvimento do nervoso central sistema. O genoma de zebrafish contém orthologs de 70% dos genes codificantes de proteínas encontrados no genoma humano bem como 84% dos genes associados a doenças em seres humanos22. Desenvolvimento de zebrafish exibe várias qualidades-chave que melhoram a sua utilização em estudos de genéticas reversos: os embriões são colocados em grandes garras, desenvolvem-se externamente da mãe tornando-os passíveis de genética manipulação por microinjeção e adultos do zebrafish sexualmente maduros por 3 meses de idade, permitindo a rápida propagação de linhas desejado23.

Existem inúmeros protocolos que descrevem uma variedade de abordagens para gerar e identificar puntuais CRISPR-derivado no zebrafish24,25,26,,27,28,29 ,30,31. No entanto, muitos desses procedimentos são tempo intensivo, requerem acesso a equipamentos caros e podem ser um desafio para laboratórios com experiência limitada. As etapas descritas neste documento fornecem uma simples, robusta e econômica CRISPR/Cas9-estratégia para engenheiro zebrafish nocaute linhas. Este protocolo descreve o uso de um kit altamente eficiente para sintetizar sgRNAs usando oligonucleotídeos de DNA (oligos), semelhante a outras abordagens que foram anteriormente descritas32. O protocolo descrito inclui duas etapas em particular que simplificar a análise das linhas CRISPR-mutação: passo a passo uso do HMA baseados em PCR33 para determinar facilmente a presença de modificações do genoma e análise de sequenciamento de zebrafish heterozigoto para rapidamente e facilmente determinar a natureza do múltiplo puntuais de forma econômica. Além disso, instruções passo a passo são incluídas para seleção robusta, confiável produção e injeção de guia RNAs. As etapas fornecidas aqui exemplificam um protocolo robusto, relativamente barato que permite que o pessoal de laboratório com uma gama de conhecimentos contribuir para a identificação dos nocautes gene no zebrafish.

Protocol

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de uso (número PACUC 31/08/11) e cuidado do Animal de Purdue. 1. projeto de Oligos modelo específico para a produção do guia do RNA Selecione a região alvo de interesse a ser modificado na região codificante do gene. Isto deve ser perto da extremidade 5′ do gene para gerar uma proteína truncada, mas não tão perto de tal forma que um codão subsequente iniciar em-frame possibilita a produção de uma proteína com uma modesta truncamento do N-terminal.Nota: Uma maneira de exclui essa possibilidade é fazer a varredura do região a jusante da codificação do gene para um quadro em começar codão. Além disso, utilizando um guia de RNA que tem como alvo no meio de um exão grande, pode ajudar a identificar primers PCR para marcar subsequentes da indel resultante. Identificar potenciais locais de guia na região genômica de interesse utilizando um guia de seleção de RNA do programa (consulte a Tabela de materiais)34,35,36. Definir os dados do navegador para Danio rerio e sequência de motivo adjacentes (PAM) de protospacer para 5′-NGG-3 ‘.Nota: Ideal gRNA sequências contêm uma 5 ‘-G na primeira posição da gRNA para eficiente T7 em vitro transcrição. Se não aceitável guia encontra-se com um G na posição 5 ‘, a base de 5 ‘ de um outro guia pode ser alterada para um G ou um G pode ser adicionado na extremidade 5 ‘ do RNA guia, mas isto pode reduzir a eficiência de corte37. Para maximizar a eficiência de corte, uma sequência de guia ideal tem conteúdo GC de 40-80% (maior é melhor) e contém um G na posiçãoth 20, ao lado do PAM, mas não é necessário38. Um exemplo de uma sequência de direcionamento ideal: 5 ‘ – G (N)18 G-3 ‘ – NGG (NGG é o PAM). Além de examinar os resultados do programa de seleção de RNA guia para identificar guia ideal RNAs como descrito acima, deve ter-se cuidado para evitar guia RNAs com previstos fortes efeitos fora do alvo e dificultar grandemente a análise a jusante. Em particular, guia RNAs com previstos efeitos fora do alvo que cair dentro regiões codificantes deve ser excluído, e os sites de fora do alvo totais previstos devem ser minimizados. Na saída da ferramenta de design da guia do RNA, excluir a sequência de PAM (NGG-5 ‘-3 ‘); Ele não é usado para o direcionamento, mas compreende a sequência de reconhecimento para Cas9 clivagem. Para os restantes 20 nucleotídeos (nts), adicionar a sequência de promotor T7 e a sequência de sobreposição (região complementar para um andaime oligo usado para sintetizar sgRNAs comprimento total fornecido com o kit de transcrição recomendados em vitro ) na ordem indicada abaixo para obter um 54 nt oligo: sequência de promotor T7: TTCTAATACGACTCACTATA-5 ‘-3 ‘; Guia de RNA sequência 5 ‘ – G (N)18 G-3 ‘; Se sobrepõem a sequência: GTTTTAGAGCTAGA-5 ‘-3 ‘ Identificar os iniciadores de PCR que ladeiam o site corte previsto (Cas9 cleaves 3 nt montante da sequência de PAM) a uma distância de 50-150 pares de bases (bp) cada do corte utilizando software baseado na web (consulte a Tabela de materiais).Nota: Estas serão usadas em uma etapa posterior para a medição da eficiência de corte. Se nenhum primers adequados são identificados usando essas restrições, outro site de RNA guia pode precisar de ser considerado. Ordem 54 oligonucleotides nt para produzir o guia primers do RNA e PCR para análise de sites de destino (consulte a Tabela de materiais).Nota: Como um controle positivo opcional, pode ser útil produzir um sgRNA como alvo um gene necessário para a produção de pigmento para verificar o desempenho do presente protocolo usando um fenótipo facilmente marcou visual (ver Figura 1 para obter resultados representativos). Um objectivo comum é o gene tirosinase, usando o oligo (guia sequência de RNA é sublinhado)39: 5 ‘-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 ‘ 2. preparação de reagentes CRISPR para microinjeção de embrião Ordem comercialmente disponível Cas9 de proteína (ver tabela de materiais).Nota: Injeção de mRNA de Cas9 também pode ser usada para gerar puntuais no zebrafish40,41, porém zebrafish microinjeção de embrião com proteína Cas9 tem demonstrada ser mais eficiente32,,42. Suspenda a proteína Cas9 o buffer fornecido para gerar uma solução de 1 mg/mL. Conservar a solução em alíquotas de injeção-pronto em cadeia da polimerase a-80 ° C para minimizar o número de ciclos de gelo-degelo. Para gerar uma solução de injeção µ l 5, 2 µ l de 1 mg/mL Cas9 solução é usada, portanto o Cas9 pode ser aliquotadas em 2 alíquotas de µ l usar tira-tubos de PCR. Sintetizar o sgRNA usando o sgRNA em vitro transcrição kit (veja a Tabela de materiais). Execute a transcrição em vitro conforme as instruções do fabricante.Nota: Manter livre de RNase técnica durante todas as etapas de preparação de solução de síntese, limpar e injeção. Por exemplo, usar luvas descartáveis e alterá-los com frequência, use tubos e dicas que são certificadas RNase-livre e limpas superfícies e pipetas com soluções comercialmente disponíveis para descontaminar o equipamento laboratorial (ver Tabela de materiais). Purifica o sgRNA sintetizado usando uma precipitação/acetato de amónio, usando a técnica de RNase-livre.Nota: Alternativamente, sgRNAs podem ser purificados usando uma variedade de comercialmente disponível RNA baseado na coluna limpar kits para um custo relativamente modesto. Adicione 25 µ l de acetato de amónio de 5m e vórtice para homogeneizar.Nota: Solução de acetato de amónio é comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais), ou uma solução de 5 M pode ser feita em casa, adicionando 385,4 mg de acetato de amónio de classe molecular a 1 mL de água livre de RNase e armazenada a-20 ° C. Adicione 150 µ l de etanol de nuclease livre 200-prova para cada amostra. Coloque a reação em um freezer-80 ° C durante um período mínimo de 20 min.Nota: As amostras podem ser armazenadas durante a noite a-80 ° C, mas não aumentará significativamente o rendimento de RNA total. Centrifugar as amostras na velocidade máxima (> 16.000 x g) numa microcentrifuga 4 ° C por 20 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante pipetando lentamente o líquido, garantindo que a pelota do RNA não seja perturbada. Adicione 1 mL de etanol a 70% (criado por diluição da nuclease-livre de etanol em água livre de RNase) e misture suavemente o tubo ele várias vezes por inversão para lavar o sal residual do tubo. Repita a etapa de centrifugação por 7 min. Remover o sobrenadante pipetando primeiro a maior parte da solução com uma pipeta P1000 e, em seguida, usar uma pipeta P200 para remover a solução tanto quanto possível, sem perturbar o sedimento. Secar a pelota do RNA em um espaço limpo, como um capuz de fluxo laminar ou uma bancada, tendo o cuidado de evitar a contaminação de RNase, durante 15 minutos ou até que não mais líquido gotas são visíveis no tubo. Resuspenda o pellet em 30 µ l de água livre de RNase, quantificar o produto (por exemplo usando um spectrophotometer) e a alíquota da solução para armazenamento a longo prazo em um freezer-80 ° C.Nota: Concentrações típicas variam de 2.500 – 800 ng / µ l. (OPCIONAL) Verifique se que completos no RNA foi gerada usando ureia/página. Como alternativa, use um gel de agarose para verificar que o RNA está intacto.Nota: No entanto, se usar um gel de agarose uma quantidade maior de gRNA deve ser executada para visualizar o RNA, e o comprimento não pode ser determinado com precisão. Ao analisar a eficiência de corte de destino após a injeção dos reagentes para o peixe, se houver pouca ou nenhuma corte presente a sgRNA deve ser verificado para degradação. Converter um gel de poliacrilamida 8% em TBE com 40% de poliacrilamida (19:1) e 8 M de ureia utilizando a técnica de RNAse-livre para as soluções e equipamentos43.Nota: Materiais comercialmente disponíveis podem ser usados para limpar o equipamento (ver Tabela de materiais). Depois o gel solidificou completamente (cerca de 30 min), equilibrar o gel, colocando-o em TBE tampão em execução e executar eletroforese por 30 min em 5 V/cm. Mix de 300 – 500 ng de sgRNA com um volume igual de 2x do carregamento de RNA gel de tingir (ver Tabela de materiais). Usando um P1000, limpe os poços de quaisquer detritos pipetando executando o tampão em cada bem várias vezes. Carregar as soluções e executar o gel a 10 V/cm por 2,5 h.Nota: Uma pista de marcador aqui é útil para visualizar o comprimento do RNA mas não é necessária; geralmente é facilmente perceptível se completo comprimento RNA tem sido sintetizados (Figura 2). Visualizar as bandas usando um ácido nucleico mancham (ver Tabela de materiais).Nota: bandas sgRNA devem aparecer como uma única banda, Considerando que manchas indica degradação de RNA (Figura 2). 3. microinjection CRISPR-componentes em embriões de peixe-zebra Configurar a noite antes da injeção, colocando o número desejados machos e fêmeas de tanques de reprodução (tipicamente 2 fêmeas e machos de 1 ou 2) em um aquário com um divisor no lugar44. Preparar um prato de microinjeção com 1,5% de agarose em mídia de x E3 1 (ver Tabela de materiais) com 0,01% de azul de metileno (fungicida) pelo derramamento 35 mL do agarose derretido em uma placa de Petri de 10 cm e colocar suavemente um molde plástico para criar depressões em forma de cunha para a solução, batendo o molde para eliminar as bolhas de ar. Permitir que a agarose definir e armazenar o prato com uma pequena quantidade de mídia e envolvido na película de parafina para evitar que a placa de secar a 4 ° C.Nota: Placas de injeção são reutilizáveis por várias semanas, até que os poços se tornar deformado ou seco, ou a placa começa a crescer o molde. Na manhã de injetáveis, descongele sgRNA purificado e proteína Cas9 no gelo. Lembre-se de lidar com todos os materiais com luvas para evitar a contaminação de RNase e usar tubos e RNase-livre dicas. Gere uma solução de injeção 5 µ l combinando Cas9 proteína e a sgRNA na proporção de 2:1 de Cas9:sgRNA para obter concentrações finais de 400 pg/nL Cas9 proteína e 200 pg/nL sgRNA. Incube a solução à temperatura ambiente por 5 min permitir que o Cas9 e sgRNA para formar um complexo de ribonucleoprotein Cas9/sgRNA. Adicionar 0,5 µ l de solução de vermelho de fenol 2,5% wt/vol (ver Tabela de materiais), e RNase-livre de água até um volume final de 5 µ l.Nota: A força iônica da solução foi mostrada para afetar a solubilidade do complexo, que portanto, a adição de KCl pode aumentar a eficiência de corte de sgRNAs que apresentam baixa indel formação28Cas9/sgRNA. Fazer uma agulha de injeção, puxando um vidro de 1,0 mm capilar usando um extrator da micropipeta. Corte a ponta da agulha acabadas usando uma lâmina de barbear nova ou uma pinça para obter uma abertura angular que será facilmente perfurar o córion e o saco vitelino. Coloque a agulha de um micromanipulador anexado a um microinjector com a fonte de ar ligada. Sob um microscópio de luz usando a ampliação adequada para a calibração determinada para o aparelho específico, ajuste a pressão de injeção até a agulha consistentemente ejeta uma 1 solução nL em uma placa de Petri preenchida com óleo mineral.Nota: A qualidade da agulha é essencial. Prática, produzindo uma agulha e injetando o saco vitelino de embriões até que esta habilidade é dominada antes de tentar outras experiências45. Retire o divisor e permitir que os peixes que se reproduzem por aproximadamente 15 min.Nota: Tempos de reprodução mais produzirá mais embriões, porém a injeção deve ser concluída enquanto os embriões estão no estágio 1-célula para maximizar a chance que corte Cas9 irá ocorrer cedo e, portanto, diminuição de mosaicismo genético. Embriões podem ser injetados em estágios posteriores (estágios de 2 – 4 células), mas isso possivelmente pode diminuir a taxa de transmissão do germline do alelo modificado. Recolher os ovos usando um filtro e lave-os em um prato de Petri usando 1 mídia x E3 com azul de metileno de 0,0001% de 10 cm. Examine a saúde dos ovos sob o microscópio de luz, removendo todos os ovos não fertilizados e detritos. Reserve 10 – 15 embriões como um controle uninjected em um prato de Petri separado, etiquetado. Utilizando uma pipeta de transferência, suavemente se alinham os ovos sobre a placa de injeção aquecido à temperatura ambiente. Sob um microscópio de dissecação na ampliação de X 2,5, injetar 1 nL da solução para o saco vitelino de cada embrião para injetar um total de 400 pg de proteína Cas9 e 200 pg de sgRNA.Nota: Para aumentar o corte se necessário ou desejado, aumentar a concentração final de proteína Cas9 para 800 pg/nL e de sgRNA a 400 pg/nL na solução de injeção; no entanto, isto pode também aumentar o corte fora do alvo e/ou diminuir o embrião da saúde. Eficiência de corte também pode ser aumentada de injetar diretamente para a célula46. No entanto, injeção no saco vitelino é tecnicamente menos exigente e dá corte suficiente para produzir peixes com transmissão germline alta (> 70% da prole que contém um alelo modificado). Retornar os embriões injetados para um prato de Petri corretamente etiquetados, cubra-os com 1 mídia x E3 com azul de metileno e colocá-los em uma incubadora de embriões conjunto para 28 ° C. Em 24h pós fertilização (hpf), inspecionar a saúde dos embriões injetados, remoção de indivíduos mortos ou anormalmente em desenvolvimento e alterar os meios de comunicação (ver Figura 3). Verifica a taxa de sobrevivência contra o controle uninjected.Nota: Quando visando um gene não essencial, a menos de 10% de letalidade é esperado em relação ao controle de uninjected. Se os níveis elevados de letalidade são observados nas populações guia-injetado em comparação com o controle uninjected, isso pode indicar que o gene alvo é essencial para o desenvolvimento, ou efeitos fora do alvo estão levando desenvolvimento fracassado. Reduzindo a quantidade de reagentes CRISPR injetados pode ser necessário ou geração de um novo sgRNA com reduzidos efeitos fora do alvo pode ser necessária. Retornar os embriões para a incubadora e continuar crescendo os embriões para 72 hpf, mudando os meios de comunicação diariamente para manter a saúde do embrião. 4. análise da eficiência da Indel formação usando um HMA Recolher dois conjuntos de cinco embriões das placas injetados crescidos para 72 hpf em microcentrifuga tubos e coletar um conjunto de cinco embriões de um controle uninjected. Anestesiar os embriões adicionando 0,004% MS-222 (tricaina) e espere 2 min. Para extrair o gDNA, delicadamente Pipetar a mídia fora cada conjunto de embrião e adicionar 45 µ l de NaOH de 50 mM. Incube os embriões a 95 ° C por 10 min. Remova os embriões a fonte de calor e frio à temperatura ambiente. Adicionar 5 µ l de 1 M Tris-HCl pH = 8 e o vórtice as amostras vigorosamente (5 – 10 s). A solução a uma velocidade máxima de centrifugação (> 16.000 x g) numa microcentrifuga temperatura de 3 min. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo e etiquetado e armazenar o gDNA a-20 ° C DNA por até 6 meses.Nota: Fragmentos de DNA de aproximadamente 900 bp e menor vai ser gerado através do uso do presente protocolo. Configure uma reação de PCR 50 µ l usando 2 µ l do preparado gDNA de cada amostra (incluindo um controle uninjected) pelas instruções incluídas com o polymerase, utilizando os primers previamente concebidos, flanqueando o site corte previsto. Purificar o PCR produtos usando um PCR limpar kit (veja a Tabela de materiais), eluir as amostras em 30 µ l de tampão de água ou eluição e quantificar o DNA utilizando um espectrofotômetro. Restabeleçam todos 30 μL de cada produto do PCR purificado, colocando os tubos em um rack flutuante em um banho de água fervente (aproximadamente 150 mL em um copo de 500 mL). Depois de 3 min, desligue a fonte de calor e permitem que as soluções arrefecer à temperatura ambiente, cerca de 1 h.Nota: Este passo primeiro desnatura o DNA e permite então que as vertentes que restabeleçam aleatoriamente para gerar possíveis doheteroduplex bandas ou incompatível DNA dobro-costa que contém polimorfismos criado por CRISPR-mutagênese e, portanto, ter um alterado mobilidade electrophoretic comparada com homoduplexes. O último ciclo de PCR ou programa rampa-para baixo no thermocycler também pode ser usado para restabeleçam produtos47,48, mas uso do banho fervente pode produzir resolução melhorada dos produtos doheteroduplex. Adicionar 5 µ l de 6 x carregamento tingir (ver Tabela de materiais) para as soluções reannealed de PCR. Conversão de um gel de poliacrilamida/TBE 15% usando 30% de poliacrilamida (29:1). Depois fixou-se o gel, colocá-lo em um aparelho de eletroforese com executando o amortecedor TBE. Usando um P1000, limpar os poços de quaisquer detritos tais como sais residuais ou gel fragmentos que podem obstruir os poços pipetando suavemente buffer de cima e para baixo nos poços várias vezes. Carga 500 ng da reannealed produtos do PCR e carregar um controle (amostra de peixes uninjected), ao lado de cada conjunto de amostras de sgRNA. Funcione o gel a 150 V por 2,5 h ou até que a tintura está na frente na parte inferior do gel. Visualizar as bandas usando uma mancha de ácido nucleico (por exemplo, brometo de etídio ou SYBR green (ver Tabela de materiais)). Examine o padrão de banda para cada controle e piscina CRISPR-injetado de embriões.Nota: O surgimento de várias bandas que são executados mais lentamente no injetado contra uninjected lanes indica a formação de produtos romance doheteroduplex (Figura 4). A presença de novela doheteroduplex DNA indica que puntuais foram geradas pela CRISPR-injeção. Redução da intensidade de banda homoduplex nas soluções injetadas de aproximadamente 50% ou superior é geralmente suficiente para resultar na transmissão do germline suficientes. Além disso, bandas extras são às vezes identificadas no peixe uninjected e não devem ser consideradas como doheteroduplex bandas quando observado no peixe injetado. Escolher as injeções com maior eficiência de corte em relação ao controle uninjected para cada destino; embriões provenientes destas injeções podem ser usados para crescer o peixe a procurar puntuais causando códons de parada prematura.Nota: Para o corte altamente eficiente (redução na banda homoduplex por aproximadamente > 50% de intensidade), peixes adultos de 20 a 30 de triagem deve ser suficiente para obter germline transmissão.Para sgRNAs que geram menos corte, peixe mais adultos pode ser necessários para aumentar a probabilidade de identificação de peixes que apresentam germline transmissão de alelos modificados contendo um códon de parada prematuro. Se indel formação não for observada, pode ser necessário redesenhar o sgRNA para uma região diferente do gene. Se for observada sem formação de banda de doheteroduplex, o sgRNA pode ter degradado e a qualidade de sgRNA deve ser verificada usando um gel de ureia/página. 5. identificação e propagação das linhas Knock-out Para identificar um potencial peixe de pai fundador, execute clipes de cauda dos peixes adultos F0 (crescidos para cerca de 2,5 – 3 meses) para identificar a presença de puntuais. Anestesiar o peixe tricaina 0,62 mM (ver Tabela de materiais), em seguida, use uma lâmina afiada, limpa para remover aproximadamente 1/2-3/4 da barbatana. Coloque a cauda em 45 µ l de NaOH de 50mm e retornar os peixes de um tanque de recuperação. Realize a extração gDNA como descritos (passos 4.2 – 4.4). Logo que o peixe retoma o comportamento de natação normal, coloque o peixe na volta fluindo água sistema até que a natureza da indel é identificada.Nota: É fundamental para garantir que peixes individuais são identificáveis e podem ser adequadamente correspondidos aos resultados dos grampos da cauda. Conforme descrito (etapas 4.5 – 4.9), executar um HMA na cauda clip gDNA para determinar se o peixe foi modificado através da injeção de CRISPR (Figura 5). Para identificar um peixe do fundador, reproduzem os adultos que apresentam bandas de doheteroduplex de gDNA de cauda de peixe selvagem-tipo. Recolher os embriões e cultivá-las para 72 hpf. Em 72 hpf, coletar 10 embriões e coloque cada embrião num tubo individual. Realizar uma extração gDNA conforme descrito acima (passos 4.2 – 4.4) usando 11,25 µ l de NaOH de 50 mM e 1,25 µ l de 1 M Tris pH = 8. Repita o PCR e eletroforese para identificar bandas doheteroduplex como descrito acima (passos 4.7 – 4.13) para determinar se indel alelos têm passados a esta geração (Figura 6). Baseado na transmissão por cento observada em embriões único usando o HMA, cresce uma média de 20 a 30 embriões obtidos pela Cruz para cada CRISPR-linhas de interesse para a vida adulta.Nota: Este número pode ser aumenta ou diminui dependendo da frequência de transmissão da linha germinal. Execute clipes de cauda dos peixes adultos F1 para identificar a presença de puntuais como descritas (etapas 5.1-5.2). Conforme descrito (etapas 4.5 – 4.11), executar um HMA na cauda clip gDNA para determinar se o peixe carrega um indel (Figura 7). Para os peixes que contêm uma banda doheteroduplex, prepare o ADN para análise de sequenciamento. Realize PCR usando novos primers para amplificar um produto PCR do bp 300 – 600 centrado em torno do local de corte. Usar um kit de purificação de PCR para limpar o DNA e eluir em 30 µ l. examinar o DNA em um gel de agarose para garantir uma única banda está presente.Nota: Algumas bandas de doheteroduplex podem estar presentes no gel do agarose e aparece como uma pequena mancha ou banda dupla logo acima do produto do PCR para o tamanho esperado. Se um a três puntuais são analisados, sequenciar os produtos PCR usando Sanger sequenciamento e determinar a sequência da indel usando uma ferramenta de Bioinformática49. Caso contrário, a determinação da sequência de múltiplos produtos PCR usando análise NGS (ver Tabela de materiais) é mais econômico. Determinar se um códon de parada prematuro foi obtido através da análise de sequência usando uma ferramenta de Bioinformática (ver Tabela de materiais). Coloque o peixe contendo o alelo mutante desejado em um tanque novo com Etiquetas apropriadas. Projetar primers PCR para alelos indel específicas para as necessidades futuras de genotipagem. Estas primeiras demão deve abranger a sequência mutante e não amplificar a sequência de tipo selvagem. Na Cruz heterozigoto zebrafish para gerar uma população segregando que irá conter linhas de nocaute de 25%.

Representative Results

As abordagens experimentais descritas neste protocolo permitem a produção eficiente e econômica de linhas de nocaute de zebrafish usando CRISPR/Cas9 tecnologia. As figuras a seguir foram incluídas neste artigo para facilitar a interpretação e solução de problemas dos resultados obtidos usando este protocolo. Após a produção bem sucedida e microinjeção de CRISPR-reagentes, os embriões de peixe-zebra podem ser analisados para fenótipos ostensivos e formação indel usando HMA. Um controle útil para visualizar o sucesso da CRISPR-experiência é o uso do sgRNA descrito na etapa 1.5 para alvejar o gene produtoras de pigmentos tirosinase. Formação induzida por Cas9 indel em tirosinase resulta em perda de pigmentação e é facilmente marcada por 48 hpf (Figura 1). Outro controle útil para assegurar que a preparação dos reagentes-CRISPR para injeção tem sido bem sucedida, é verificar que completos (120 nt) sgRNA tem sido sintetizado usando um gel de polyacrylamide desnaturalização (Figura 2, faixa 1 e 2). Se o RNA foi degradado pode parecer como uma mancha, por exemplo 3 Lane (Figura 2) mostra o RNA degradado que não é adequado para injeção. Para analisar a frequência de formação indel de genes alvejado de CRISPR-Cas9 que não resultam em fenótipos evidentes, como a tirosinase, HMA análise é um método simples e confiável. sgRNA/Cas9 injetado embriões analisados usar HMA resulta na formação de bandas de doheteroduplex e redução da intensidade da banda homoduplex (Figura 4). A presença de bandas de doheteroduplex é mais utilizada neste protocolo para identificar potenciais peixe fundador de embriões microinjected e como adultos (Figura 4 e Figura 5), para analisar a eficiência de transmissão do germline do fundador ( Figura 6) e para verificar a presença de um indel em um peixe heterozigoto de F1 (Figura 7). Os peixes heterozigotos que contêm um indel são candidatos para NGS para identificar a natureza da indel e determinar se um códon de parada prematuro está presente na região codificante do gene alvo. Figura 1 : Zebrafish embriões apresentam um defeito de pigmento quando injetado com um direcionamento tirosinase na fase de uma célula de sgRNA. (A) selvagem-tipo, uninjected embrião 48 hpf e (B) injetado embrião 48 hpf. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Transcrição in vitro de sgRNA usando o kit de síntese. Oligos foram sintetizados usando em vitro transcrição de acordo com as instruções de kit de síntese sgRNA. 500 ng do RNA foi executado em um gel de ureia/página conforme descrito. sgRNA carregado nas pistas 1 e 2 mostra uma banda correspondente ao comprimento cheio, intacta 120 nt RNA. O sgRNA na pista 3 mostra um exemplo de RNA degradado que não é adequado para injeção. Figura 3 : Comparação da saúde de 24 embriões hpf injetado. Um embrião de vida (A) desenvolvido para 24 hpf, facilmente se distingue de um embrião que foi anulada desenvolvimento (B). Embriões que se assemelham a (B) ou tem drasticamente alteraram características para (A), tais como a curvatura da coluna vertebral ou alteraram a cabeça e o desenvolvimento do olho deve ser removido do prato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de sgRNA-Cas9 injetadas embriões zebrafish. Piscinas de 5 embriões por amostra foram coletadas em 72 hpf e gDNA foi extraído. Doheteroduplex a análise foi realizada conforme descrito, as amostras foram carregadas igualmente com 500 ng de DNA. Pistas: M = 100 marcador bp; 1 = controle uninjected; 2 = injeção amostra 1; 3 = amostra injeção 2. Espera-se tamanho de banda = 98 bp. Figura 5 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de gDNA extraído do rabo de um adulto CRISPR-injetado zebrafish. Os embriões que foram injetados com um sgRNA e proteína Cas9 foram cultivados à idade adulta (3 meses). Peixe B e C apresentam bandas doheteroduplex e posteriormente foram criados para identificar puntuais germline transmitido; peixe A não foi usado na análise posterior, pois não apresentam uma banda de doheteroduplex positivo. Pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2 = peixe A; 3 = peixe B; 4 = tamanho de banda peixe C. esperado = 98 BP clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de embriões único gerado pela reprodução um zebrafish F0 CRISPR-injetado para um peixe selvagem-tipo para identificar germline transmitido puntuais. Zebrafish foram acasaladas e os embriões de F1, produção de embriões único de 72 h. foram coletados e doheteroduplex análise realizada conforme descrito. Pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2-10 = um único embrião F1 por faixa. Este gel mostra que 7 de 10 embriões mostram uma banda doheteroduplex positiva, indicando uma taxa de transmissão do germline de 70% da indel. Espera-se tamanho de banda = 98 BP clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7 : Ensaio de mobilidade doheteroduplex de clipes de cauda adultos F1 zebrafish. Peixes adultos de F1 foram marcados por HMA para identificar puntuais. Peixes que exibiram uma banda doheteroduplex positivos foram PCR amplificados e enviada para análise de sequenciamento de ampla para determinar a natureza da mutação. (A) pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2 = peixe uma (4 bp exclusão, 1 incompatibilidade de bp). (B) estes F1 peixes foram identificadas a partir do mesmo fundador e ainda mostram diferente doheteroduplex, padronização, indicando transmissão germline de múltiplos alelos modificados de um único fundador. Pistas: 1 = controle do selvagem-tipo; 2 = peixe B (4 inserção de bp, incompatibilidade de bp 7), 3 = peixe C (4 bp de exclusão, incompatibilidade de bp 4). Cada um destes puntuais criou um códon de parada prematuro na sequência de codificação do gene alvo, conforme determinado pela NGS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo descreve a produção dos nocautes gene no sistema de vertebrados modelo zebrafish usando tecnologia CRISPR-Cas9. Um número de protocolos anteriormente foram descrito para realizar engenharia de genoma CRISPR-mediada no zebrafish15,25,26,50,,51,,52. Este protocolo baseia-se na anteriores esforços pela combinação de um número de técnicas experimentais simples contudo reproducibly consistentes, em especial HMA e NGS de vários peixes heterozigotos, para criar um simples, econômico e experimentalmente robusto protocolo para mutagénese CRISPR-mediada no zebrafish que é apropriado para laboratórios compostos pessoal com uma gama de formação e experiência, bem como laboratórios de ensino.

Recomendações para o projeto e a síntese de RNAs estão incluídos neste protocolo de guia. Uma consideração principal na guia design do RNA é a minimização dos efeitos fora do alvo. Vários algoritmos de previsão foram desenvolvidos para permitir que os usuários CRISPR acessar ferramentas de computação com interfaces gráficas amigáveis que predizem tanto a atividade do guia no alvo e a chance de efeitos fora do alvo34, 35,36. Uma vantagem específica do sistema de zebrafish é abaixadas taxas de efeitos fora do alvo porque o Cas9 é injetado em embriões e, portanto, a expressão é transitória, que foi mostrado em ratos para resultar em diminuição da efeitos fora do alvo53. No entanto, foram demonstrados efeitos fora do alvo para ocorrer em zebrafish54. Uma forma de controle para efeitos fora do alvo é de fenótipo fundador zebrafish que foram gerados por dois RNAs de guia independente que destino o mesmo gene, como estes guias seria muito prováveis que afetam diferentes sites de fora do alvo. Um método alternativo para minimizar efeitos fora do alvo que não esteja descrito neste protocolo é o uso de um mutante Cas9 que gera único quebras no DNA, alvo que são reparadas com alta eficiência. Cortes de DNA dentro de proximidade um do outro que são complementares para o oposto de emparelhamento vertentes resultados na formação eficaz indel no locus desejado e minimiza os efeitos fora do alvo55,56.

Além de ter diferentes taxas de efeitos fora do alvo, sgRNAs diferentes podem ter diferentes taxas de mutagênese do alvo desejado57,58,59. Este protocolo utiliza HMA para analisar a eficiência de mutagênese de um determinado sgRNA usando doheteroduplex banda formação33,40. Doheteroduplex bandas são criadas por hibridação de geradas por PCR de DNA que contêm inadequações e pode ser facilmente resolvido usando electroforese em gel. Ao contrário de outros métodos comumente usados para medir a indel formação, tais como a endonuclease T7 ensaio ou alta resolução derreter análise25,26, HMA não requer uma enzima cara para cortar DNA incompatível e não requer complicada análise de PCR derreter as curvas. Importante, usar HMA para verificar taxas elevadas da indel formação na população injetada também permite que o investigador minimizar o número de peixes necessários para a produção subsequente de linhas de mata-mata, o que reduz o custo de identificar uma mutação com o características desejadas.

A relativa facilidade de gerar puntuais CRISPR-base permite a criação de múltiplos alelos de vários genes ao mesmo tempo. Software baseado em Web está disponível para análise de mutações única de peixes heterozigotos usando Sanger sequenciamento dos produtos PCR49. No caso onde analisam-se três ou mais alelos CRISPR-mutado, NGS para caracterizar a natureza da indel é provável ser mais rentável para caracterizar a natureza da indel como essa abordagem permite que uma piscina de até 50 diferentes alelos para ser caracterizado em ó NCE (ver Tabela de materiais)60,61,62. Essa economia de escala provavelmente seria particularmente útil em um ambiente de laboratório de graduação.

Em resumo, este protocolo fornece instruções passo a passo para gerar reproducibly CRISPR-reagentes de alta qualidade (em particular, sgRNA), tal que menos peixes adultos precisam ser criados e analisados para identificar com sucesso os alelos mutantes de interesse, que também reduz o tempo e o custo de gerar as linhas desejadas. Importante, este protocolo foi projetado tais que pode ser aplicado por laboratórios com recursos limitados para produzir o peixe-zebra mutante de forma acessível. Além disso, descobrimos que essa abordagem é apropriada para alunos de graduação e assim expande as oportunidades de educação e formação de alunos de graduação interessados em experiência hands-on no genoma CRISPR-baseado de edição.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R21CA182197 de J.O.), o Ralph W. e Grace M. Showalter pesquisa confiança e pela ciência agrícola de Purdue e extensão para o programa de desenvolvimento econômico (AgSEED). Dados de sequenciamento Sanger foram adquiridos pela facilidade de Purdue Genomics Core suportada pelo P30 CA023168. Mary Witucki foi apoiado pelo centro da Universidade de Purdue para câncer verão graduação pesquisa programa de pesquisa apoiado pela Associação de câncer no Condado de Carroll. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Benjamin Carter, Ellen Denning e Taylor Sabato para fornecer feedback crítico sobre o manuscrito. Agradecemos o departamento de bioquímica para apoio deste trabalho e o centro de pesquisas de Zebrafish na Universidade de Purdue, por sua dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de zebrafish. Finalmente, agradecemos a instalação de núcleo de genômica Purdue, e contribuições de Phillip San Miguel no que respeita os serviços NGS.

Materials

CRISPOR sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/
Breaking-Cas sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChop sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3 PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free technique http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free water Any brand Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.
Rnase-free ethanol Any brand Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.
Cas9 Protein PNA Bio CP01 Cas9 protein with nuclear localization signal.
Target specific oligos Integrated DNA Technologies (IDT) Synthesize guide RNAs.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.
EnGen sgRNA Synthesis Kit New England BioLabs E3322 In vitro transccribe guide RNAs.
10X TBE Thermo Fisher B52 RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.
6X Load Dye New England BioLabs B7025S Loading DNA for electropheresis.
5M Ammonium acetate Thermo Fisher AM9071 Clean up reagent for purification of guide RNAs.
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any brand Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.
Nuclease-free Water Any brand For synthesis and purification of guide RNAs.
RNase away Thermo Fisher 10328011 Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.
DNA Ladder, 100 bp New England BioLabs N0467S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
DNA Ladder, 1 kb New England BioLabs N0552S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
RNA Ladder New England BioLabs N0364S Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized
TEMED Thermo Fisher 17919 Casting polyacrylamide gel.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Casting polyacrylamide gel.
40% Polyacrylamide (19:1) BioRad 161-0154 Casting denaturing polyacrylamide gel.
Urea Sigma-Aldrich U5378-100G Casting denaturing polyacrylamide gel.
RNA Gel Loading Dye (2x) Thermo Fisher R0641 Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510-10ML Visualization of nucleic acids.
SYBER Green Thermo Fisher S7563 Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.
Microcentrifuge Eppendorf 5424 RNA clean up, PCR purification.
MyTaq Polymerase Bioline BIO-21105 For amplification of DNA using PCR.
Thermocycler Any brand PCR amplification.
Spectrophotometer Any brand NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.
E3 embryo media Made in house Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140 Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish Thermo Fisher FB0875711Z Store embryos, cast injection plate.
Agarose Denville CA3510-8 Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold Adaptive Science Tools TU-1 To create wells to hold embryos during injection.
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290  Dye for visualization of injection.
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5904-5ML To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes Any brand Moving embryos.
Razor blade Thermo Fisher 11295-10 Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator Any brand Maintaining embryos at 28.5 oC.
Verticle pipette puller David Kopf Instruments 700C Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes Sutter Instruments BF100-58-10 Geneate needles for injection.
Microloader tips Eppendorf 930001007 Load solution into injection needles.
Microinjector World Precision Instruments PV 820 Injecting embryos.
Disecting microscope Leica Injecting embryos.
30% Polyacylamide (29:1) BioRad 161-0156 Heteroduplex gel casting.
MS-222 (Tricaine) Sigma-Aldrich A-5040 Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Microwave Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Scale Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Gloves Any brand For all aspects of the protocol.
N2 Any brand To expell liquid from the capillary for embryo injection.
1,000 µL  tips Any brand For all aspects of the protocol.
200 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
10 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
PCR strip tubes Any brand For all aspects of the protocol.
Micropipettes Any brand For all aspects of the protocol.
NGS Sequencing platform: Wideseq If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).
Software for sequence analysis For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software for sequence analysis SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.
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Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. J. Vis. Exp. (138), e56969, doi:10.3791/56969 (2018).
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