効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

ケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従い、本研究を行った。プロトコルは、パーデュー大学動物ケアおよび使用委員会 (PACUC 数 11/08/31) によって承認されました。 1. テンプレート固有 Oligos のガイド RNA の生産のための設計 遺伝子のコーディング領域で変更される興味のターゲット地域を選択します。これは切り捨てられたタンパク質を生成がないので後続のフレームの開始コドンささやかな N 末端切り捨てと蛋白質の生産を有効にするように遺伝子の 5′ 端に近いはずです。注: この可能性を排除する方法の 1 つのフレームの開始コドン遺伝子の下流のコーディング領域をスキャンすることです。さらに、大きなエクソンの中間をターゲットとする RNA のガイドを使用して、結果の塩基の後続のスコアリングのための PCR プライマーを識別するために助けることができます。 RNA 選択ガイドを使用して興味のゲノムの地域の潜在的なガイドのサイトを識別するプログラム (参照材料表)34,35,36。ブラウザーのデータを動脈分布および 5′-NGG-3 する protospacer 隣接するモチーフ (PAM) シーケンスに設定 ‘。注: 理想的な gRNA シーケンスは、能率的なトランスクリプション体外T7 の gRNA の最初の位置に 5 ‘ G を含んでいます。別のガイドの 5 ‘ベースを変更することできます 5’ の位置にある G と許容可能なガイドがない場合、ガイド RNA の 5 ‘ 端に G または G を追加できますが、これは切削効率37を減らすことができます。切削効率を最大にする最適ガイド シーケンスは GC 含量が 40-80% (より優れている)、パムに隣接して 20th位置に G が含まれていますが、必要な38ではないです。理想的なターゲット シーケンスの例: 5 ‘-G (N)18 G-3’ – NGG (NGG は PAM)。最適なガイド Rna 前述を識別するガイド RNA 選択プログラムの実行結果を調べるほか大幅ダウン ストリーム解析を困難にしている予測の強いオフターゲット効果を持つガイド Rna を避けるために注意をすべき。特に、予測のオフターゲット効果予測総オフのターゲット サイトを最小化する必要があります、コード領域内の落下を除外すべきで Rna を導きます。 ガイド RNA 設計ツールの出力から除外 PAM シーケンス (NGG 5 ‘-3 ‘);それは対象化されていないが、Cas9 胸の谷間の認識シーケンスで構成します。 T7 プロモーターと重複シーケンス (推奨の in vitro転写キットで提供される完全な長さの sgRNAs の合成に使用される足場オリゴに相補的な領域) 追加残り 20 ヌクレオチド (nts)、示されている順序で54 nt オリゴを入手するには下: T7 プロモーター: TTCTAATACGACTCACTATA 5 ‘-3 ‘;RNA シーケンス 5 ‘-G (N)18 G をガイド-3 ‘;重複シーケンス: GTTTTAGAGCTAGA 5 ‘-3 ‘ フランクの予測カット サイト PCR プライマーを識別 (Cas9 裂く 3 PAM シーケンスの上流 nt) 50-150 塩基対 (bp) 各 web ベースのソフトウェアを使用してカットからの距離で (材料の表を参照してください)。注: とこれら切削効率の測定の後の手順で使用されるします。適切なプライマーが識別されない場合これらの制約を使用して、別のガイド RNA サイトは考慮する必要があります。 注文ガイドを生成する 54 の nt オリゴヌクレオチド (材料の表を参照) のターゲット ・ サイトの分析のための RNA および PCR のプライマー。メモ: オプションの肯定的な制御として簡単に得点の視覚的表現を使用してこのプロトコルの性能を検証する顔料の生産に必要な遺伝子をターゲット sgRNA を生成するとよいでしょう (代表的な結果を得るのための図 1を参照)。共通の目標は、遺伝子チロシナーゼoligo の使用 (ガイド RNA シーケンスに下線を引く)39: 5 ‘-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 ‘ 2. 胚マイクロインジェクションの CRISPR 試薬の調製 市販の Cas9 蛋白質を注文 (材料の表を参照してください)。注: Cas9 mRNA の注入は、しかしより効率的な32,42Cas9 蛋白質とゼブラフィッシュ胚マイクロインジェクションを示されている、ゼブラフィッシュ40,41, オクターリピートを生成する使用もできます。 1 mg/mL の溶液を生成する指定されたバッファーで Cas9 蛋白質は中止します。凍結融解サイクルの数を最小限に抑える-80 ° C で PCR チューブで注入準備因数でソリューションを保存します。したがって 1 mg/ml Cas9 ソリューションを使用すると、2 μ L、5 μ L 注入ソリューションを生成するには、Cas9 することができます PCR ストリップ管を使用して 2 μ 因数で避けようとあります。 SgRNAの in vitro転写を使用して sgRNA を合成キット (材料の表を参照してください)。製造元の指示に従っての in vitro転写を実行します。注: は、すべての合成、クリーンアップ、および注入ソリューション準備手順中に RNase フリー技術を保持します。たとえば、使い捨て手袋を使用して、それらを頻繁に変更、チューブと RNase フリー認定ときれいな表面は、実験器具を染する市販ソリューションをピペットの先端を使用して (材料の表を参照してください)。 RNase フリー法を用いた酢酸アンモニウム/沈殿物を使用して合成の sgRNA を浄化します。注: または、sgRNAs ことができる精製するクリーン アップ キット市販列に基づく RNA のさまざまな比較的適度な費用のため。 5 M 酢酸アンモニウムと混和する渦の 25 μ L を追加します。注: アンモニウム酢酸溶液は市販 (参照材料表)、または 5 M 溶液を RNase フリー水 1 mL に酢酸アンモニウム分子グレード 385.4 mg を追加することで家で行われた、-20 ° C で保存できます。 200-証拠ヌクレアーゼ フリー エタノール 150 μ L を各サンプルに追加します。20 分以上-80 ° C のフリーザーに反応を配置します。注: サンプルは-80 ° C で夜通し保存することができますが大幅に総 RNA の収穫は増えません。 遠心分離機の最大速度でサンプル (> 16,000 x g) 20 分の 4 ° C 遠心機で。 RNA ペレットを妨げないことを確認、液体をゆっくりとピペッティング上澄みを慎重に削除します。 (ヌクレアーゼ フリー エタノール RNase フリーの水で希釈することによって作成された) 70% エタノール 1 mL を加えるし、軽くミックス チューブをチューブから残留塩を洗浄する数回を反転します。 7 分間遠心分離のステップを繰り返します。 P1000 ピペットを使用して、ソリューションの大部分を最初ピペットで上澄みを除去し、ペレットを混乱させないでできるだけ多くのソリューションを削除する P200 ピペットを使用します。層流フードなどベンチトップ、RNase の混入に注意しながら、きれいな空間で RNA のペレットを乾燥、15 分間またはないより多くの液体になるまで滴チューブに表示。 RNase フリーの水の 30 μ L でペレットを再懸濁します、製品 (たとえば分光光度計を使用して) そして因数-80 ° C のフリーザーで長期的なストレージのためのソリューションを定量化します。注: 標準的な濃度範囲 800-2,500 ng/μ L から。 (省略可能)尿素/ページを使用して、フルの長さの RNA を生成されていることを確認します。また、agarose のゲルを使用して RNA が維持されていることを確認します。注: ただし、agarose のゲルを使用して gRNA の大規模な量が、RNA を視覚化する実行する必要がある、長さは正確に決定することはできません。No か少しカットの存在がある場合、対象魚への試薬の注入後切断の効率を分析する際は、劣化のために、sgRNA をチェックしなければなりません。 40% ポリアクリルアミドゲル (19:1) と RNAse フリーの手法を用いたソリューションおよび機器438 M 尿素 TBE で 8% のポリアクリルアミドゲルをキャストします。注: 市販の材料は、装置をきれいに使用できます (材料の表を参照してください)。 ゲルが完全に (約 30 分) を固化後は、それを置くことによってゲルを平衡 TBE バッファーを実行して、5 V/cm で 30 分間の電気泳動の実行で。 ミックス RNA ゲル ロード × 2 の等量と sgRNA の 300-500 ng を染める (材料の表を参照してください)。P1000 を使用して、各も数回でバッファーを実行をピペッティングしてエアダスターの井戸を消去します。ソリューションを読み込み、2.5 h の 10 V/cm でゲルを実行します。注: ここでレーンでマーカーが RNA の長さを視覚化するのに役立ちますは必要ありません。一般的にそれは容易に明白な場合における長さの RNA がされている (図 2) を合成しました。 視覚化する核酸を使用してバンド染色 (材料の表を参照してください)。注: スミア RNA の劣化 (図 2) を示すに対し、sgRNA バンドは単一バンドとして表示されます。 3. CRISPR コンポーネントのゼブラフィッシュの胚へのマイクロインジェクション 繁殖タンク希望の男性と女性の数を配置することによって注入する前に夜を設定 (通常 2 人の女性と 1 または 2 の男性) で分周器飼育槽で44を配置。 10 cm シャーレに溶かしたアガロースの注ぐ 35 ml 0.01% メチレン ブルー (殺菌剤) と 1 x E3 メディア (材料の表を参照) で 1.5% の agarose が付いてマイクロインジェクション プレートを準備し、穏やかに谷をくさび状を作成するプラスチック金型を置く、ソリューション、気泡を除去するためにカビをタップします。 設定、メディアの少量が付いている皿を格納して agarose を許可し、プレートが 4 ° C で乾燥するを防ぐためにパラフィン フィルムで包まれる注: 射出プレートは、井戸になる変形や乾燥、またはプレート金型を成長を開始するまで数週間、再利用可能です。 注入の朝、浄化された sgRNA と Cas9 蛋白質氷の上を解凍します。手袋 RNase の混入を防ぐために、RNase フリーのヒントとチューブを使用するすべての材料を処理してください。 Cas9 蛋白質および 400 pg/nL Cas9 タンパク質の最終濃度を取得する Cas9:sgRNA の 2:1 の比率で sgRNA や 200 pg/nL sgRNA を組み合わせることによって 5 μ L 注入剤を生成します。Cas9/sgRNA ソリューション リボ核蛋白質複合を形成する Cas9 と sgRNA を許可する 5 分間室温で孵化させなさい。2.5 %wt/巻フェノールレッド溶液 0.5 μ L を追加 (材料の表を参照)、5 μ L の最終巻に水 RNase フリーします。注: Cas9/sgRNA の複雑な KCl の添加が低塩基形成28を示す sgRNAs の切削効率を増加するための溶解度に影響を与える、溶液のイオン強度が示されています。 注射針は 1.0 mm ガラスを引いてキャピラリー マイクロ ピペットの引き手を使用してください。新しいかみそりの刃や鉗子を使用して簡単に卵黄嚢、絨毛膜に穴を開ける斜めの開口部を取得する新鮮な製の針の先端をカットします。 オン エア源のマイクロに添付マイクロマニピュレーターに針を置きます。決定特定装置の校正に適した倍率を使用して光学顕微鏡、下針は一貫して鉱物油でいっぱいシャーレに 1 nL ソリューションをイジェクトするまで噴射圧力を調整します。注意: 針の品質が重要です。前に、さらに実験45針を生産、これはスキルまでを胚の卵黄嚢に注射の練習を習得します。 区分線を削除し、約 15 分のために繁殖する魚。注: 繁殖時間が長くより多くの胚を作り出す、早く、したがって減少遺伝子モザイクが発生しますその Cas9 カット チャンスを最大化する 1 細胞期胚がいる間の注入の完了しかし。胚は後の段階 (2-4 セル段階) で注入することが、これがおそらく変更された対立遺伝子の生殖細胞系の伝送速度を低下します。 ストレーナを使用して卵を収集し、10 cm シャーレ 1 x E3 メディアを用いた 0.0001% メチレン ブルーにそれらをすすいでください。未受精卵および残骸の取り外し、光学顕微鏡下で卵の状態を確認します。 別のラベルが付いたペトリ皿で uninjected コントロールとして 10-15 胚置いておきます。 部屋の温度に温めて注入皿に卵のラインアップ転送ピペットを使用して、優しく。 2.5 倍の倍率で解剖顕微鏡、注入 1 Cas9 蛋白質の 400 の pg と sgRNA の 200 pg の合計を挿入するソリューションをそれぞれの胚の卵黄嚢の nL。注: 場合は希望や必要に応じて切削を増やす、注射溶液; で 400 pg/nl sgRNA の 800 pg/nl Cas9 タンパク質の最終濃度に増加します。しかし、これがまた増加オフターゲット切断、または減少胚健康。切削効率は、セル46に直接注射することによって増やされるかもしれません。ただし、卵黄の袋への注入は技術的に以下の要求と魚の高い生殖を生成するための十分な切削を与える (> 変更された対立遺伝子を含む子孫の 70%)。 注入された胚を正しくラベル付けされたペトリ皿に戻り、メチレン ブルーで 1 x E3 メディアとそれらをカバー、28 ° C に設定胚インキュベーターに入れてください 24 時間受精 (hpf) の記事、死亡あるいは異常開発個人の取り外し、注入された胚の正常性を検査およびメディア (図 3参照) を変更します。Uninjected コントロールに対して生存率を確認します。Uninjected コントロールに対して相対的なときメモ: 致死率 10% 未満の不要な遺伝子をターゲットとなっています。致死性の高いレベルは、uninjected コントロールと比較してガイド注入集団で観察される、目標とされた遺伝子は、開発に不可欠な的外れの効果失敗した開発をリードしていることがあります。注入された CRISPR 試薬の量を減らす必要があります。 または減少オフターゲット効果を持つ新しい sgRNA の生成が必要になる場合があります。 インキュベーターに胚を戻すし、72 に胚を成長を続ける hpf、胎児の健康を維持するために毎日のメディアを変更します。 4、HMA を使用して塩基形成の効率の解析 Uninjected コントロールから、5 つの胚のマイクロ遠心チューブ用と収集に hpf セットを 72 に成長して注入されたプレートから 5 つの胚の収集 2 つ設定します。 0.004% を追加することによって胚を麻酔 MS-222 (tricaine) 2 分待ってと。 GDNA を抽出、優しく各胚のセットをメディアのピペット、50 mM NaOH の 45 μ L を追加します。10 分 95 ° C で胚を孵化させなさい。 部屋の温度の熱源とクールから胚を削除します。1 M トリス塩酸の pH を 5 μ l 添加精力的に 8、および渦のサンプルを = (5-10 秒)。最大速度で溶液を遠心分離機 (> 16,000 x g) 3 分常温遠心機できれいで、ラベルの付いたチューブに上清を転送し、6 ヶ月-20 ° c DNA gDNA を格納します。注: 約 900 bp の小さい DNA のフラグメントこのプロトコルの使用によって生成されます。 2 μ L (uninjected コントロールなど) 各サンプルから準備された gDNA を使用して 50 μ L の PCR 反応を予測カット サイトを並ぶ以前に設計されたプライマーを用いたポリメラーゼに含まれている指示に従って設定します。 PCR の浄化クリーンアップを PCR を使用して製品キット (材料の表を参照してください)、水や溶出バッファーの 30 μ L のサンプルを溶出、分光光度計を使用して DNA の定量化します。 沸騰水浴 (500 mL ビーカーに約 150 mL) で浮くラックにチューブを配置することによって、各精製 PCR の製品のすべての 30 μ L を reanneal します。3 分後、熱源を切り、室温に約 1 時間冷却ソリューションを許可します。注: この手順まず DNA を変化でき、その後ランダムに生成可能なヘテロ二本鎖バンドに reanneal ために鎖、または不一致の二重鎖 DNA 多型を含む CRISPR 変異によって作成され、したがって、変更があります。電気泳動度の homoduplexes と比較して。PCR または、たちのランプダウン プログラムの最後のサイクルは製品47,48、reanneal にも使用できますが、沸騰したお湯の使用はヘテロ二本鎖製品の分解能を向上をもたらす可能性があります。 ロード x 6 の 5 μ L を追加 reannealed PCR ソリューション (材料の表を参照) を染めます。 30% ポリアクリルアミドゲル (29:1) を使用して 15% ポリアクリルアミド/TBE ゲルをキャストします。ゲルが設定後、TBE バッファーを実行しているが電気泳動装置に配置します。P1000 を使用して、または残留塩ような残骸の井戸をオフに軽くピペッティング バッファー上下に井戸に数回で井戸を妨げることができる断片をゲルします。 Reannealed PCR の製品、および負荷 sgRNA サンプルの各セットの横にあるコントロール (uninjected 魚からサンプル) の負荷 500 ng。150 V 2.5 h またはゲルの底が色素前面までのゲルを実行します。 核酸染色を使用してバンドを可視化する (例えば、エチジウム ブロマイドや SYBR グリーン (材料の表を参照))。 各コントロールと胚の CRISPR 注入プールのバンド パターンを調べます。注: 複数の外観は、挿入の実行速度が低下するバンド uninjected レーンと新規ヘテロ二本鎖製品 (図 4) の形成を示します。新規ヘテロ二本鎖 DNA の存在は、オクターリピートが CRISPR 注入によって生成されたことを示します。約 50% 以上注入ソリューションで homoduplex バンド強度の減少は一般に十分な生殖の結果に十分です。さらに、余分なバンド uninjected 魚で時々 認識し、注入された魚で観測した時のヘテロ二本鎖バンドを見なすべきではないです。 各ターゲットの uninjected コントロールを基準として最高の切削効率を持つ注射を選択します。これらの注射から胚を使用して、魚を探す時期尚早停止コドンを引き起こしてオクターリピート育つできます。注: 高能率加工 (約 > 50% の強度による homoduplex バンドの低減)、20-30 成魚をスクリーニングする必要があります生殖を得るのに十分です。低いカットを生成する sgRNAs より多くの大人の魚は時期尚早停止コドンを含む変更された対立遺伝子の生殖の展示魚の識別の可能性を高めるに必要ことがあります。塩基形成遺伝子の別の領域に sgRNA を再設計する必要があります見られない場合。ヘテロ二本鎖バンド形成を認められなかった場合、sgRNA が低下した可能性があり、尿素/ページのゲルを使用して sgRNA の品質を確認する必要があります。 5. 身分証明書と伝搬のノック アウトの行 潜在的な創設者親魚を識別する (約 2.5-3 ヶ月に成長) オクターリピートの存在を識別するために大人の F0 魚の尾クリップを実行します。0.62 mM tricaine で魚を麻酔 (材料の表を参照)、清潔度、シャープのかみそりの刃を使用して約 1/2-3/4 の垂直尾翼を削除します。 尾は 50 mm NaOH、45 μ L 回収タンクに魚を返却してください。説明されている (手順 4.2 〜 4.4) として gDNA 抽出を実行します。魚再開される通常の遊泳行動と、流れに戻って魚を置くシステム水は塩基の性質が特定されるまで。注: 個々 の魚が識別できると尾クリップの結果を適切に照合できるように重要です。 前述の (手順 4.5 – 4.9)、尾クリップ gDNA CRISPR 注入 (図 5) で魚が変更されたかを決定するために、HMA を実行します。創設者魚を識別するために繁殖する野生型魚に尾 gDNA からヘテロ二本鎖バンドを示す大人。胚を収集し、それらを 72 に育てる hpf。 72 で hpf 10 胚を収集し、それぞれの胚が、個々 のチューブ。50 mM NaOH の 11.25 μ L と 1 M トリス pH の 1.25 の μ L を使用して (手順 4.2-4.4) 上記 gDNA 抽出を実行 = 8。 この世代 (図 6) に塩基の対立遺伝子に渡されているかどうかを決定するために (ステップ 4.7-4.13) で前述のヘテロ二本鎖バンドを識別する PCR と電気泳動を繰り返します。 HMA を使用して 1 つの胚にみられる透過率に基づいて、各 CRISPR 線成人に関心のために十字架によって取得 20-30 胚の平均を成長します。注: この番号が増加または生殖の周波数に応じて減少しました。 説明されている (手順 5.1-5.2) としてオクターリピートの存在を識別するために大人の F1 魚の尾クリップを実行します。前述の尾クリップ gDNA 魚が、塩基 (図 7) を運ぶかどうかを決定するために、HMA を実行 (手順 4.5-4.11)。 ヘテロ二本鎖バンドが含まれている魚、DNA シーケンス解析のため準備します。 カットのサイトを中心とした、300-600 bp の PCR の製品を増幅する新しいプライマーを用いた PCR を実行します。 PCR 精製キット、DNA をクリーンアップし 30 μ L の溶出を使用は、単一のバンドが存在する agarose のゲルの DNA を確認します。注: バンディングいくつかのヘテロ二本鎖 agarose のゲルに存在する、小さな塗抹または予想されるサイズで PCR の製品のすぐ上の二重バンドとして表示されます。 1 ~ 3 オクターリピートを分析した場合、シーケンス サンガーを使用して PCR の製品のシーケンス処理とバイオインフォマティクス ツール49を使用して塩基の順序を決定します。そうでなければ、NGS 解析を用いた複数の PCR の製品のシーケンスの決定 (材料の表を参照) はより経済的であります。 判断は時期尚早停止コドンをバイオインフォマティクスのツールを使用してシーケンスを分析することによって受けたかどうか (材料の表を参照してください)。 適切なラベルを持つ新しいタンクに必要な突然変異体の対立遺伝子を含む魚をプレイス. 将来ジェノタイピング ニーズの対立遺伝子を特定塩基の PCR プライマーを設計します。これらのプライマーが変異のシーケンスにまたがる、野生型シーケンスを増幅されていません。 クロスのヘテロ ゼブラフィッシュ 25% ノック アウトの行を含む分離人口を生成します。