L’editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall’emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l’identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l’analisi di mobilità dell’eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.
Caratterizzazione dei cluster, regolarmente intervallate, breve, palindromi ripetere (CRISPR) sistema di Streptococcus pyogenes ha consentito lo sviluppo di una piattaforma personalizzabile per generare velocemente le modifiche gene in un’ampia varietà di organismi, tra cui zebrafish. Editing basato su CRISPR genomico utilizza una sola guida RNA (sgRNA) per indirizzare un’endonucleasi CRISPR-collegata (Cas) ad un target di DNA (gDNA) genomica di interesse, dove l’endonucleasi Cas genera una rotture a doppio filamento (DSB). Riparazione di DSBs di piombo errori meccanismi per inserimenti e/o delezioni (indels). Ciò può causare mutazioni frameshift che spesso introducono un codone di stop prematuro all’interno la sequenza codificante, creando così un allele di proteina da null. Basato su CRISPR genoma ingegneria richiede solo pochi componenti molecolari e facilmente è stato introdotto negli embrioni di zebrafish di microiniezione. Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per generare i reagenti CRISPR per il microinjection di zebrafish e identificare pesce espositrici trasmissione nella linea germinale dei geni CRISPR-modificato. Questi metodi includono trascrizione in vitro di sgRNAs, microiniezione di reagenti CRISPR, identificazione di indels indotto al sito di destinazione utilizzando un metodo basato su PCR chiamato un analisi di mobilità dell’eteroduplex (HMA) e la caratterizzazione dei indels utilizzando sia un basso rendimento e un potente sequenziamento di nuova generazione (NGS)-base di approccio che può analizzare i prodotti di PCR più raccolti da pesci eterozigoti. Questo protocollo è ottimizzato per ridurre al minimo il numero di pesci richiesto sia i tipi di attrezzature necessarie per eseguire le analisi. Inoltre, questo protocollo è progettato per essere favorevole per l’uso da personale di laboratorio di tutti i livelli di esperienza tra cui undergraduates, consentendo di questo potente strumento da impiegare economicamente da qualsiasi gruppo di ricerca interessato a condurre basati su CRISPR modifica genomica in zebrafish.
La conservazione di macchine molecolari attraverso eucarioti sottende il potere di utilizzare organismi modello per la ricerca. Molti di questi sistemi modello facilitare l’uso di approcci di genetica inversa come TNA knockouts genica mirata a caratterizzare il contributo di un prodotto del gene di un processo biologico o malattia di interesse. Tecniche di rottura del gene in organismi come zebrafish hanno storicamente invocata Introduzione mirata di mutazioni frameshift che derivano da riparazione imprecisa di DSBs1,2. Quando un DSB è stato introdotto nel genoma, la lesione del DNA è riparata attraverso una delle due vie che sono universalmente presenti in quasi tutti i tipi di cellule e organismi: non-omologo fine unirsi (NHEJ) e riparazione omologia-diretto (HDR)3,4 . L’imprecisione del macchinario NHEJ produce frequentemente indels di varie lunghezze5,6,7,8,9. Introduzione di mutazioni frameshift nella sequenza di codificazione di un gene in grado di produrre un codone di stop prematuro, che spesso rende il gene non funzionali.
Strategie di ingegneria genoma iniziali in zebrafish per promuovere indels includono meganucleases, nucleasi a dita di zinco e nucleasi di attivatore-come effettore trascrizione, tutti di cui utilizzato interazioni della DNA-proteina per impostare come destinazione una nucleasi a uno specifico genomica destinazione dove ha introdotto un DSB10,11,12,13,14,15. Tuttavia, queste tecnologie sono spesso difficili da applicare a causa la laboriosa e complessa ingegneria necessaria per generare una nucleasi che rivolge la sequenza di DNA di interesse. A differenza delle precedenti strategie, basate su CRISPR gene editing non si basa su interazioni proteina-DNA per il targeting. Invece, l’endonucleasi CRISPR-collegata (Cas) sono diretto tramite una guida di RNA che utilizza del nucleotide base pairing interazioni di destinare un sito genomico di interesse16,17,18,19 ,20,21. Grazie alla semplicità di progettazione di un RNA guida con la base desiderata interazioni per bersagliandola di accoppiamento è relativamente facile per indirizzare l’endonucleasi di Cas per il luogo desiderato. Il tipo sistema di II CRISPR in particolare è stato ampiamente sviluppato per applicazioni di editing del genoma a causa di diverse caratteristiche vantaggiose, compreso l’uso di una singola nucleasi Cas multidominio (Cas9) che richiede l’interazione con il DNA per stimolare attività endonucleasica e uso di una singola guida RNA (sgRNA) per scegliere come target e le cognate di sequenza di DNA18. I requisiti di sequenza necessari per il targeting del sgRNA cognata sono ben compreso19, e il sgRNA desiderato è facilmente generato da trascrizione in vitro . La semplicità e la robustezza dell’approccio CRISPR/Cas9 facilita enormemente la modificazione genetica mirata in zebrafish e una vasta gamma di altri organismi.
La maggiore capacità di intraprendere l’editing genomico mirato in zebrafish come risultato lo sviluppo di reagenti a base CRISPR ha significativamente aumentato la possibilità di studiare processi emblematici di organismi vertebrati come sviluppo del sistema nervoso centrale sistema. Il genoma di zebrafish contiene ortologhi del 70% dei geni codificanti per proteine trovati il genoma umano, nonché l’84% dei geni associati a malattie in esseri umani22. Zebrafish sviluppo esibisce parecchie qualità chiave che migliorano l’utilizzo in studi di genetica inverso: gli embrioni vengono deposte in grandi frizioni, sviluppano esternamente dalla madre che li rende suscettibili di genetica manipolazione di microiniezione e zebrafish adulto sessualmente maturi entro 3 mesi dell’età, permettendo per propagazione rapida di righe desiderate23.
Sono disponibili numerosi protocolli che descrivono una varietà di approcci per generare e identificare CRISPR-derivato indels in zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Tuttavia, molte di queste procedure sono tempo intensivo, richiedono l’accesso all’apparecchiatura costosa e può essere difficile per i laboratori con limitata esperienza in campo. I passaggi descritti nel presente documento forniscono una semplice, robusta ed economica CRISPR/Cas9-strategia per ingegnere zebrafish knockout linee. Questo protocollo descrive l’uso di un kit altamente efficiente per sintetizzare sgRNAs usando i oligonucleotides del DNA (oligos), simile ad altri approcci che sono stati precedentemente descritto32. Il protocollo descritto include due passaggi in particolare che semplificano notevolmente l’analisi delle linee CRISPR-mutato: dettagliata uso della PCR-basata HMA33 determinare facilmente la presenza di modificazioni del genoma e l’analisi di sequenziamento di eterozigote zebrafish rapidamente e facilmente determinare la natura di più indels in modo economico. Inoltre, le istruzioni dettagliate sono incluse per selezione robusto, affidabile produzione e iniezione di guida RNAs. I passaggi descritti qui esemplificano un protocollo robusto, relativamente poco costoso che permette al personale di laboratorio con una gamma di competenze contribuire all’identificazione dei Ko del gene in zebrafish.
Questo protocollo descrive la produzione di knockout del gene nel sistema modello vertebrati zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Un numero di protocolli precedentemente è state descritte per intraprendere ingegneria CRISPR-mediata del genoma in zebrafish15,25,26,50,51,52. Questo protocollo si basa su precedenti sforzi combinando una serie di tecniche sperimentali semplici ma riproducibile coerente, in particolare HMA e NGS di più pesci eterozigoti, per creare un semplice, economico e sperimentalmente robusto protocollo per mutagenesi CRISPR-mediata in zebrafish che è adatto per i laboratori con personale con una gamma di esperienza e formazione, nonché a laboratori didattici.
Consigli per la progettazione e sintesi di guida che RNAs sono inclusi in questo protocollo. Una considerazione importante nella Guida di progettazione di RNA è la minimizzazione degli effetti fuori bersaglio. Diversi algoritmi di previsione sono stati sviluppati per consentire CRISPR-agli utenti di accedere agli strumenti di calcolo con facile da usare interfacce grafiche che consentono di stimare sia l’attività della guida sulla destinazione e la possibilità di effetti fuori bersaglio34, 35,36. Un vantaggio specifico del sistema zebrafish è abbassato i tassi di effetti fuori bersaglio perché la Cas9 è iniettato in embrioni e quindi espressione è transitoria, che ha dimostrato nei topi per provocare una riduzione fuori bersaglio effetti53. Tuttavia, sono stati dimostrati effetti fuori bersaglio per accadere in zebrafish54. Un modo per controllo per effetti fuori bersaglio è a fenotipo fondatore zebrafish che sono stati generati da due RNA guida indipendente che utilizzano lo stesso gene, in quanto queste guide sarebbe molto probabile che influiscono su diversi siti fuori bersaglio. Un metodo alternativo per ridurre al minimo gli effetti fuori bersaglio che non è descritto in questo protocollo è l’utilizzo di un mutato Cas9 che genera rotture del singolo filo al bersaglio del DNA, che sono riparate con alta efficienza. Abbinamento del DNA Nick nelle immediate vicinanze di un altro che sono complementari all’opposto strands risultati nella formazione di indel efficace al luogo desiderato e minimizza gli effetti fuori bersaglio55,56.
Oltre ad avere diversi tassi di effetti fuori bersaglio, sgRNAs diversi possono avere diversi tassi di mutagenesi del target desiderato57,58,59. Questo protocollo utilizza HMA per analizzare l’efficienza di mutagenesi di un determinato sgRNA utilizzando dell’eteroduplex band formazione33,40. Bande dell’eteroduplex vengono creati tramite l’ibridazione di filamenti di DNA PCR-generato che contengono disadattamento e può essere facilmente risolto utilizzando l’elettroforesi del gel. A differenza di altri metodi comunemente usati per misurare indel formazione, quali le endonucleasi T7 dosaggio o alta risoluzione sciogliere analisi25,26, HMA non richiede un enzima costoso per tagliare il DNA non corrispondente e non richiede complicate analisi di PCR si fondono le curve. Soprattutto, anche utilizzando HMA per verificare i tassi alti di indel formazione nella popolazione iniettata consente al ricercatore di ridurre al minimo il numero di pesci necessari per la successiva produzione di linee di knock-out, che riduce il costo di identificazione di una mutazione con il caratteristiche desiderate.
La relativa facilità di generazione basato su CRISPR indels consente la creazione di alleli multipli di geni multipli in una sola volta. Software web-based è disponibile per l’analisi delle singole mutazioni eterozigoti pesce utilizzando Sanger sequenziamento di prodotti PCR49. Nel caso in cui sono analizzati tre o più alleli mutati CRISPR, NGS per caratterizzare la natura della indel è probabilmente più efficace in termini di costo per caratterizzare la natura di indel come questo approccio consente un pool di fino a 50 diversi alleli per essere caratterizzato in o NCE (Vedi Tabella materiali)60,61,62. Tale economia di scala probabilmente sarebbe particolarmente utile in un ambiente di laboratorio dello studente non laureato.
In sintesi, questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione riproducibile CRISPR-reagenti di alta qualità (in particolare, sgRNA) tale che un minor numero di pesci adulti devono essere creati e analizzati per identificare con successo gli alleli del mutante di interesse, che riduce anche il tempo e il costo di generare le righe desiderate. D’importanza, questo protocollo è stato progettato tali che può essere applicato dai laboratori con risorse limitate per la produzione di zebrafish mutanti in maniera conveniente. Inoltre, abbiamo trovato che questo approccio è adatto per gli studenti universitari e così si espande le opportunità di istruzione e formazione di studenti universitari interessati a un’esperienza pratica in editing basato su CRISPR genomico.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R21CA182197 di J.O.), il Ralph W. e Grace M. Showalter Research Trust e dal Purdue scienze agrarie ed estensione per il programma di sviluppo economico (AgSEED). Dati di sequenziamento Sanger sono stati acquisiti da parte dell’impianto di Purdue Genomics Core supportati da P30 CA023168. Mary Witucki è stata sostenuta dal Purdue University Center per cancro ricerca estate Undergraduate Research programma supportato dalla Carroll County Cancer Association. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno di studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo Benjamin Carter, Ellen Denning e Taylor Sabato per fornire un feedback critico sul manoscritto. Ringraziamo il dipartimento di biochimica per il supporto di questo lavoro e il centro di ricerca di Zebrafish presso la Purdue University per la loro dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia di zebrafish. Infine, ringraziamo il Core genomica di Purdue e contributi di Phillip San Miguel per quanto riguarda i servizi NGS.
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |