JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Published: August 28, 2018
doi:
10.3791/56969
, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University

Summary

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

Abstract

אפיון באשכולות, באופן קבוע interspaced, קצר, palindromic חוזר (CRISPR) מערכת של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת אפשרה פיתוח פלטפורמה להתאמה אישית כדי ליצור במהירות שינויים ג’ין במגוון רחב של אורגניזמים, כולל דג זברה. הגנום מבוססי CRISPR עריכת משתמש מדריך בודד RNA (sgRNA). המטרה של endonuclease הקשורים CRISPR (Ca) ליעד דנ א (gDNA) גנומית של עניין, איפה endonuclease Cas יוצר הפסקה כפולה-סטרנד (DSB). תיקון של DSBs על ידי מנגנוני לשגיאות להוביל הוספות או מחיקות (indels). זה יכול לגרום מוטציות frameshift לעתים קרובות להציג codon עצירה מוקדמת בתוך הרצף קידוד, ובכך ליצור אלל חלבון-null. הגנום מבוססי CRISPR דורשת רק כמה רכיבים מולקולרית והנדסה בקלות מוחדרים העוברים דג זברה על-ידי microinjection. פרוטוקול זה מתאר שיטות השתמשו כדי ליצור CRISPR ריאגנטים עבור דג זברה microinjection וכדי לזהות דגים מפגין germline שידור של גנים CRISPR-השתנה. שיטות אלה כוללות חוץ גופית בתוך שעתוק של sgRNAs, microinjection של CRISPR ריאגנטים, זיהוי של indels המושרה באתר היעד באמצעות שיטה מבוססת-PCR הנקראת heteroduplex ניידות assay (HMA), וכן אפיון indels שימוש של תפוקה נמוכה והן של עוצמה הדור הבא רצפי (הגדרות)-לפי הגישה ניתן לנתח מספר מוצרים PCR שנאסף דגים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים. פרוטוקול זה הוא יעיל יותר כדי למזער את מספר הדגים הנדרשים והן את סוגי הציוד הדרוש כדי לבצע את הניתוח. יתר על כן, פרוטוקול זה תוכנן להיות מקובל לשימוש על-ידי מעבדה האישי של כל רמות ניסיון כולל סטודנטים, הפעלת כלי רב עוצמה כלכלית להיות מועסק על ידי קבוצת מחקר כלשהו מעוניין בביצוע מבוסס-CRISPR שינוי גנטי בדג זברה.

Introduction

שימור מכונות מולקולריות על פני פרוקריוטים ביסוד בכוח באמצעות מודל אורגניזמים למחקר. רבות ממערכות אלה דגם להקל על השימוש של גישות הפוכה-גנטית כמו ג’ין יישוב הסתרה כדי לאפיין את התרומה של מוצר ג’ין לתהליך ביולוגי או מחלה של ריבית. טכניקות שיבוש גנטי אורגניזמים כגון דג זברה יש היסטורית הסתמך על יישוב מבוא של מוטציות frameshift הנובעים תיקון מדויק של DSBs1,2. כאשר DSB מוחדרים הגנום, הנגע DNA יתוקן בזו של שני המסלולים הקיימים אוניברסלית כמעט כל סוגי תאים ואורגניזמים: קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR)3,4 . הטבע מדויק של מכונות NHEJ מייצרת לעתים קרובות indels השונים אורכים5,6,7,8,9. הקדמה של frameshift מוטציות ברצף קידוד של גנים יכול לייצר codon עצירה מוקדמת, אשר לעתים קרובות הופך את הגן מתפקד.

מוקדם אסטרטגיות הנדסיות הגנום דג זברה כדי לקדם את indels כולל meganucleases nucleases אבץ-אצבע, תמלול אפקטור activator דמוי nucleases, אשר מנוצל אינטראקציות חלבון-דנ א למטרה של נוקלאז מסוים גנומית היעד שבו הוא הציג DSB10,11,12,13,14,15. עם זאת, טכנולוגיות אלה לעיתים קרובות קשה להחיל עקב ההנדסה מייגעת ומורכבת הדרושים כדי ליצור נוקלאז שמכוונת את רצף ה-DNA של עניין. בניגוד אסטרטגיות הקודם, ג’ין מבוססי CRISPR עריכה לא להסתמך על אינטראקציות חלבון-DNA עבור מיקוד. במקום זאת, endonuclease הקשורים CRISPR (Ca) מכוונת דרך מדריך RNA המשתמשת נוקלאוטיד הבסיס זיווג אינטראקציות למטרה אתר גנומית של ריבית16,17,18,19 20, ,21. בגלל הפשטות של עיצוב של RNA מדריך עם הבסיס הרצוי זיווג אינטראקציות הכוונת זה קל יחסית למקד את endonuclease Cas על מיקומה הרצוי. הסוג השני CRISPR מערכת בפרט נרחב פותחה עבור יישומים לעריכת הגנום עקב מספר תכונות יתרון כולל שימוש יחיד וחשבונות קס נוקלאז (Cas9) שדורש אינטראקציה עם ה-DNA כדי לעורר פעילות endonuclease שימוש RNA מדריך יחיד (sgRNA) כדי להגדירה על רצף ה-DNA cognate18. הדרישות רצף הכרחי עבור פילוח של sgRNA cognate ובכן מובן19, sgRNA הרצוי נוצר בקלות על ידי שעתוק במבחנה . הפשטות ואת החוסן של הגישה CRISPR/Cas9 מאוד מקל שינוי גנטי יישוב בדג זברה ועוד מגוון רחב של אורגניזמים אחרים.

היכולת המשופרת מתחייב הגנום יישוב עריכה בדג זברה בעקבות פיתוח ריאגנטים מבוססי CRISPR יש באופן משמעותי גדל הזדמנות ללמוד תהליכים הסמלי של אורגניזמים חוליות כגון התפתחות המרכזי עצבני מערכת. הגנום דג זברה מכיל orthologs של 70% של גנים חלבונים הנמצאים את הגנום האנושי, כמו גם 84% של גנים הקשורים במחלות בני22. דג זברה פיתוח מוצגים מספר האיכויות מפתח המשפרים את השימוש בו מחקרים גנטיים הפוכה: העוברים הונחו ב וזעקה גדולה, לפתח חיצוני מהאם הפיכתם מניפולציה נוטה גנטי על ידי microinjection, דג זברה למבוגרים בוגרת מינית על ידי 3 חודשים של גיל, המאפשר התפשטות מהירה של השורות הרצוי23.

פרוטוקולים רבים זמינים המתארים את מגוון של גישות להפיק ולזהות נגזר CRISPR indels דג זברה24,25,26,27,28,29 30, ,31. עם זאת, רבים של הליכים אלה הן זמן אינטנסיבי, דורשים גישה לציוד יקר, עשויה להיות מאתגרת עבור מעבדות עם מומחיות מוגבלת. השלבים המתוארים בזאת מספקים פשוט, עמיד וחסכוני CRISPR/Cas9-אסטרטגיה לקווים נוקאאוט של מהנדס דג זברה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש ערכה יעילה במיוחד לסנתז sgRNAs באמצעות DNA oligonucleotides (oligos), בדומה גישות אחרות שהיו בעבר תיאר32. הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים בפרט במידה רבה לפשט ניתוח של מוטציה CRISPR קווים: השימוש HMA מבוססי ה-PCR33 בקלות לקבוע הנוכחות של הגנום שינויים, וניתוח רצף של צעד אחר צעד דג זברה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים במהירות ובקלות לקבוע את אופי indels מרובות בצורה חסכונית. בנוסף, הוראות שלב אחר שלב כלולים עבור ובחירת חזקים, יצור אמינים, הזרקה של מדריך RNAs. השלבים שסופק כאן להדגים פרוטוקול חזקות, זולה יחסית המאפשרת עובדי מעבדה עם מגוון של התמחויות לתרום לזיהוי של ג’ין הסתרה של דג זברה.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים. הפרוטוקול אושר על ידי Purdue חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (PACUC מספר 08-031-11). 1. עיצוב של תבנית ספציפית Oligos לייצור מדריך ה-RNA בחר את אזור היעד לעניין להיות שונה באזור קידוד של הגן. זה צריך להיות קרוב 5′ לסוף הגן כדי ליצור חלבון קטום, אבל לא כל כך קרוב כזה codon התחלה במסגרת עוקבות מאפשר ייצור של חלבון עם חיתוך צנוע N-מסוף.הערה: אחת הדרכים לצמצם את האפשרות הזו היא לסרוק את האזור קידוד במורד הזרם של הגן עבור מסגרת בתוך להתחיל codon. בנוסף, באמצעות מדריך RNA שמכוונת אמצע אקסון גדולים, יכולים לסייע בזיהוי PCR הבקיע עוקבות של ויאסין וכתוצאה מכך צבעי יסוד. לזהות פוטנציאל מדריך האתרים באזור גנומית עניין באמצעות מדריך RNA בחירה בתוכנית (ראה טבלה של חומרים)34,35,36. הגדר את הנתונים דפדפן רזבורה rerio ואת הרצף מוטיב סמוכים (פאם) protospacer ל 5′-הגולה-3′.הערה: רצפים gRNA אידיאלי להכיל יונקות-G במקום הראשון של gRNA עבור יעיל T7 במבחנה שעתוק. אם אין מדריך מקובל נמצא עם G במיקום יונקות, ניתן לשנות את בסיס יונקות מדריך נוסף כדי ניתן להוסיף על גבי יונקות סוף המדריך RNA G או G, אבל זה עשוי להפחית את יעילות חיתוך37. כדי למקסם את היעילות חיתוך, רצף אופטימלי מדריך יש תוכן GC 40-80% (גבוה יותר הוא טוב יותר), ואת מכיל G במיקוםה 20, סמוך פאם, אך אינו נדרש38. דוגמה של רצף מיקוד אידיאלי: יונקות G (N) -18 G-3′ – הגולה (הגולה הוא פאם). בנוסף בחינת התוצאות של התוכנית הבחירה RNA מדריך לזיהוי אופטימלית מדריך RNAs כמתואר לעיל, להקפיד להימנע מדריך RNAs עם החזוי תופעות מחוץ-יעד חזק אשר במידה רבה לסבך את הניתוח במורד הזרם. בפרט, מדריך RNAs עם אפקטים את המטרה החזוי כי נפילה מגובה של קידוד אזורים לא להיות כלולים, האתרים הכולל את המטרה לחזות צריך להיות ממוזער. מהפלט של כלי העיצוב מדריך RNA, אל תכלול את רצף פאם (יונקות-הגולה-3′); זה אינו בשימוש עבור מיקוד אך כוללת את רצף זיהוי למחשוף Cas9. הנותרים 20 נוקלאוטידים (nts), הוסף את רצף יזם T7 ואת הרצף חפיפה (אזור משלים oligo לגרדום בשימוש לסנתז sgRNAs באורך מלא המסופקים בערכה שעתוק המומלצת במבחנה ) לפי הסדר שצוין להלן כדי להשיג oligo nt 54: רצף יזם T7: יונקות-TTCTAATACGACTCACTATA-3′; מדריך RNA רצף יונקות G (N) -18 G-3′; חופפים ברצף: יונקות-GTTTTAGAGCTAGA-3′ לזהות תחל PCR מחזיתות האתר לחתוך החזוי (Cas9 cleaves 3 nt במעלה הזרם של הרצף פאם) ממרחק של 50 – 150 בסיסי זוגות (bp) כל אחד מן החתך באמצעות תוכנה מבוססת אינטרנט (ראה טבלה של חומרים).הערה: אלה ישמש בשלב מאוחר יותר למדידת יעילות חיתוך. אם לא תחל מתאימים מזוהים באמצעות אילוצים אלה, אתר אחר של RNA מדריך אולי צריכים לקחת בחשבון. סדר oligonucleotides 54 nt כדי לייצר את המדריך תחל RNA ו- PCR לניתוח של האתרים היעד (ראה טבלה של חומרים).הערה: כפקד של חיובי אופציונלי, עשוי להיות שימושי לייצר sgRNA מיקוד גנים הדרושים לייצור של פיגמנט כדי לאמת את הביצועים של פרוטוקול זה שימוש של פנוטיפ חזותי בקלות הצליחו (ראו איור 1 תוצאות נציג). יעד משותף הוא ג’ין tyrosinase, באמצעות את oligo (מדריך רצף ה-RNA מסומנת בקו תחתון)39: יונקות-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3′ 2. הכנה של ריאגנטים CRISPR העובר Microinjection סדר זמינים מסחרית חלבון Cas9 (ראה טבלה של חומרים).הערה: הזרקה של Cas9 mRNA יכול לשמש גם כדי ליצור indels דג זברה40,41, אולם דג זברה microinjection העובר עם חלבון Cas9 הוכח להיות יעיל יותר32,42. להשעות את החלבון Cas9 במאגר שסופק כדי ליצור פתרון 1 מ”ג/מ”ל. אחסן את הפתרון מוכן-הזרקת aliquots ב המבחנות ב- 80 ° C כדי לצמצם את מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה. כדי ליצור פתרון µL הזרקת 5, µL 2 של 1 מ”ג/מ”ל Cas9 פתרון משמש, לכן Cas9 יכול להיות aliquoted ב 2 aliquots µL באמצעות רצועת-המבחנות. לסנתז את sgRNA באמצעות sgRNA במבחנה שעתוק קיט (ראה טבלה של חומרים). לבצע שעתוק במבחנה לפי הוראות היצרן.הערה: לשמור על טכניקה ללא RNase במהלך כל סינתזה, לנקות, הזרקת פתרון הכנה השלבים. לדוגמה, להשתמש בכפפות חד פעמיות, לשנות אותם לעתים קרובות, שימוש צינורות וטיפים מוסמך ללא RNase, משטחים נקיים, פיפטות עם פתרונות זמינים מסחרית כדי decontaminate מכשור מעבדתי (ראה טבלה של חומרים). לטהר את sgRNA מסונתז באמצעות משקעים של אמוניום/אצטט נטולת RNase בטכניקה.הערה: לחלופין, sgRNAs יכול להיטהר באמצעות מגוון של RNA מבוססי עמודה זמינים מסחרית לנקות ערכות תמורת תשלום צנוע יחסית. להוסיף 25 µL של 5 מ’ אמוניום אצטט ו מערבולת לערבב ביסודיות.הערה: אמוניום אצטט פתרון זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים), או פתרון 5 מ’ יכול להיות שנעשו בבית על-ידי הוספת מ”ג 385.4 אצטט אמוניום כיתה מולקולרית 1 מ”ל של מים נטולי RNase ומאוחסנים ב-20 ° C. להוסיף 150 µL של 200-הוכחה ללא נוקלאז אתנול כל דגימה. מקם את התגובה במקפיא-80 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 20 דקות.הערה: הדגימות ניתן לאחסן במשך הלילה ב-80 מעלות צלזיוס, אך לא יגדיל משמעותית את התשואה הכוללת של RNA. Centrifuge את הדגימות במהירות המרבית (> g 16,000 x) ב- microcentrifuge 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הסר את תגובת שיקוע בקפידה על ידי לאט pipetting את הנוזל, הבטחת שבגדר RNA לא מופרע. להוסיף 1 מ”ל אתנול 70% (שנוצרו על ידי דילול נטולת נוקלאז אתנול במים נטולי RNase) ומערבבים בעדינות את הצינורית על-ידי היפוך זה מספר פעמים כדי לשטוף את משקעי מלח באמצעות הרכבת התחתית. חזור על השלב צנטריפוגה במשך 7 דקות. הסר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting הראשון את מרבית הפתרון באמצעות פיפטה P1000 ולאחר מכן השתמש על פיפטה P200 להסיר כמה שיותר פתרון ככל האפשר מבלי perturbing בגדר. יבש בגדר RNA בחלל נקי, כגון תא למינארי או ספסל מלמעלה, נזהר למנוע זיהום RNase, למשך 15 דקות או עד אין נוזל יותר טיפות גלויים בצינור. Resuspend בגדר ב 30 µL של מים נטולי RNase, לכמת את המוצר (למשל באמצעות ספקטרופוטומטרים), ואת aliquot הפתרון לאחסון לטווח ארוך במקפיא-80 ° C.הערה: ריכוזי טיפוסי נע בין 800 – 2,500 ng/µL. (אופציונלי) ודא כי ה-RNA באורך מלא נוצרה באמצעות שתנן/עמוד. לחלופין, השתמש של ג’ל agarose כדי לאמת הרנ א ללא פגע.הערה: עם זאת, אם באמצעות ג’ל agarose של כמות גדולה של gRNA יש להפעיל כדי להמחיש את הרנ א, לא ניתן לקבוע במדויק האורך. כאשר מנתחים את היעילות של היעד חיתוך לאחר ההזרקה של ריאגנטים לתוך הדג, אם יש חיתוך אין או מעט נוכח ואז sgRNA צריך להיבדק על השפלה. ליהק ג’ל לזיהוי של 8% TBE עם 40% לזיהוי (19:1), אוריאה שמונה מ’ באמצעות טכניקה ללא RNAse עבור ציוד43והפתרונות.הערה: חומרים זמינים מסחרית יכול לשמש לניקוי ציוד (ראה טבלה של חומרים). אחרי הג’ל התחזק לחלוטין (כ- 30 דקות), equilibrate את הג’ל על-ידי הצבתו ב TBE הפעלת מאגר וביצוע אלקטרופורזה למשך 30 דקות של 5 V/ס מ. מיקס 300 – 500 ננוגרם של sgRNA עם אמצעי אחסון שווה של 2 x RNA ג’ל הטעינה לצבוע (ראה טבלה של חומרים). שימוש של P1000, ברור הבארות של נפולת על ידי pipetting םילעופה מאגר כל היטב מספר פעמים. לטעון את solution(s) ולהפעיל את הג’ל על 10 V ס עבור 2.5 h.הערה: מסלול סמן כאן היא שימושית להמחיש את משך הרנ א אך אינו נדרש; בדרך כלל זה בולט לעין אם מלא אורך RNA היה מסונתז (איור 2). דמיינו הלהקות בעזרת חומצת גרעין כתם (ראה טבלה של חומרים).הערה: להקות sgRNA אמורה להופיע כלהקה יחיד, ואילו מריחת מציין RNA השפלה (איור 2). 3. microinjection של CRISPR-רכיבים לתוך עוברי דג זברה להגדיר את גידול טנקים בלילה לפני הזרקת על ידי הצבת מספר הרצוי זכרים ונקבות (בדרך כלל 2 נקבות וזכרים 1 או 2) במקום מיכל רבייה עם מחיצה ב-44. להכין צלחת microinjection עם 1.5% agarose בתקשורת x E3 1 (ראה טבלה של חומרים) עם 0.01% מתילן כחול (פונגוסייד) על ידי שפיכת 35 מ ל agarose נמס לתוך 10 ס מ פטרי ולהניח בעדינות את כייר פלסטיק ליצירת בצורת טריז שקתות לתוך פתרון, הקשה כייר לחסל בועות אוויר. לאפשר את agarose להגדיר, ולאחסן את הצלחת עם כמות קטנה של מדיה, עטוף בסרט פרפין כדי למנוע את הצלחת מתייבש ב 4 º C.הערה: הזרקת צלחות הם לשימוש חוזר למשך מספר שבועות, עד הבארות להיות מעוותים או יבש, או הצלחת מתחילה לגדול עובש. בבוקרו של הזרקת, להפשיר מטוהרים sgRNA וחלבון Cas9 על הקרח. זכור כדי להתמודד עם כל החומרים עם כפפות כדי למנוע זיהום RNase וכדי להשתמש עצות חינם RNase וצינורות. ליצור פתרון הזרקת µL 5 על ידי שילוב של חלבון Cas9, את sgRNA על יחס של 2:1 של Cas9:sgRNA כדי להשיג ריכוזים הסופי של 400 pg/nL חלבון Cas9, 200 pg/nL sgRNA. דגירה הפתרון Cas9/sgRNA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי לאפשר את Cas9 ואת sgRNA ליצור ribonucleoprotein מורכבים. להוסיף 0.5 µL של 2.5% wt/כרך פנול אדום פתרון (ראה טבלה של חומרים), ומים ללא RNase לאמצעי הסופי של 5 µL.הערה: כוח יונית של הפתרון הוכח להשפיע על המסיסות Cas9/sgRNA מורכבות, שולכן התוספת של אשלגן כלורי עשוי להגביר את היעילות חיתוך של sgRNAs כי התערוכה ויאסין נמוך מערך28. להפוך מחט הזריקה על ידי משיכת 1.0 מ מ זכוכית נימי באמצעות של פולר micropipette. חותכים את קצה המחט טרייה באמצעות גילוח חדש או מלקחיים כדי להשיג שום פתח בזווית בקלות ידקרו את chorion ואת שק חלמון. המחט micromanipulator צמוד microinjector עם מקור אוויר מופעלת. תחת מיקרוסקופ אור בעזרת ההגדלה מתאים הכיול נקבע עבור מנגנון מסוים, התאם את הזרקה בלחץ עד המחט בעקביות פולט פתרון nL 1 לתוך צלחת פטרי מלא שמן מינרלי.הערה: האיכות של המחט היא קריטית. תרגול הפקת מחט, הזרקת לתוך שק החלמון של עוברי עד שזה מיומנות הוא mastered לפני ניסיון נוסף ניסויים45. הסרה של הקו המפריד ולאפשר את הדגים להתרבות במשך כ 15 דקות.הערה: פעמים פורייה יותר יפיק יותר עוברי, אולם הזריקה אמורה להסתיים בעוד העוברים נמצאים בשלב 1-תא כדי למקסם את הסיכוי הזה חיתוך Cas9 תתרחש מוקדם ולכן ירידה גנטי. יכול להיות מוזרק עוברי בשלבים מאוחרים יותר (2 – 4 תאים שלבים), אבל זה אולי עשויה להקטין את קצב שידור germline אלל ששונה. לאסוף את הביצים בעזרת מסננת ולשטוף אותם לתוך 10 ס מ פטרי באמצעות מדיה x E3 1 0.0001% מתילן כחול. לבחון את בריאותו של הביצים במיקרוסקופ אור, הסרת כל הביצים מופרית ופסולת. להפריש 10 – 15 עוברי כפקד של uninjected בצלוחית נפרדת, עם תוויות. באמצעות פיפטה העברה, בעדינות בשורה את הביצים בצלחת הזרקת להתחמם לטמפרטורת החדר. תחת מיקרוסקופ לנתיחה בהגדלה X 2.5, להזריק 1 nL של הפתרון לתוך שק החלמון של העובר כל להזריק סך של 400 pg Cas9 החלבון, עמ’ 200 של sgRNA.הערה: כדי להגדיל חיתוך אם הרצויה או הכרחי, להגדיל את הריכוז הסופי של Cas9 חלבון כדי pg 800/nL ושל sgRNA כדי pg/nL 400 בפתרון הזרקת; עם זאת, זה עלול גם להגדיל את המטרה חיתוך ו/או להקטין את בריאות העובר. יעילות חיתוך עשוי גם להיות מוגברת על ידי הזרקת ישירות לתוך התא46. עם זאת, הזרקה לתוך שק חלמון טכנית פחות תובענית, נותן חיתוך מספיק כדי לייצר דגים עם שידור גבוהה germline (> 70% של הצאצאים המכיל של אלל ששונה). להחזיר את העוברים מוזרק צלחת פטרי שכותרתו כראוי, לכסות אותם עם מדיה 1 x E3 עם כחול מתילן, ולשים אותם בתוך אינקובטור העובר מוגדר כ- 28 מעלות צלזיוס. ב 24 שעות פוסט הפריה (hpf), לפקח על העוברים מוזרק, הסרת אנשים מתים או באופן חריג המתפתח הבריאות ושנה את המדיה (ראה איור 3). בדוק את שיעור ההישרדות נגד הפקד uninjected.הערה: כאשר המיקוד של ג’ין לא חיוניות, פחות מ-10% lethality צפוי יחסית הפקד uninjected. אם רמות גבוהות של הקטלניות הם נצפו על האוכלוסיות המוזרק מדריך בהשוואה הפקד uninjected, זה עשוי להצביע על כי הגן יישוב חיוני להתפתחות, או את המטרה אפקטים מובילים להתפתחות שנכשלו. הפחתת כמות ריאגנטים CRISPR מוזרק עשוי להיות נחוץ או מהדור sgRNA חדש עם אפקטים את המטרה מופחת עשוי להידרש. להחזיר את העוברים החממה ולהמשיך לגדול העוברים ל 72 hpf, שינוי התקשורת מדי יום כדי לשמור על בריאות העובר. 4. ניתוח של היעילות של היווצרות ויאסין באמצעות HMA לאסוף שתי קבוצות של חמישה העוברים מן הלוחות מוזרק גדל ל- 72 hpf לתוך צינורות microcentrifuge ואחד לאסוף שוכן חמישה העובר פקד uninjected. עזים ומתנגד העוברים על-ידי הוספת 0.004% MS-222 (tricaine) והמתן 2 דקות. כדי לחלץ את gDNA, בעדינות pipette התקשורת את כל ערכת העובר ולהוסיף µL 45 מ מ 50 NaOH. דגירה העוברים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר העוברים מקור החום וקריר לטמפרטורת החדר. להוסיף 5 µL של 1 מ’ טריס-HCl pH = 8 ו מערבולת הדגימות נמרצות (5 – 10 s). Centrifuge הפתרון במהירות מקסימלית (> g 16,000 x) ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי, שכותרתו ולאחסן את gDNA ב-20 ° C דנ א עד 6 חודשים.הערה: שברי DNA של 900 bp ורצון קטנים להיווצר על-ידי שימוש בפרוטוקול זה. להגדיר את תגובת ה-PCR µL 50 באמצעות 2 µL של gDNA מוכן של כל דגימה (כולל פקד uninjected) לפי ההוראות הכלולות של פולימראז, באמצעות תחל בעבר מעוצב של איגוף האתר לחתוך החזוי. לטהר את ה-PCR מוצרים באמצעות PCR לנקות קיט (ראה טבלה של חומרים), elute את הדגימות ב µL 30 מאגר מים או • תנאי ולכמת את הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. Reanneal כל 30 µL של כל מוצר ה-PCR מטוהרת על ידי הנחת הצינורות במעמד floatable באמבט מים רותחים (כ 150 מ”ל בתוך 500 מ”ל). לאחר 3 דקות, לכבות את מקור החום ולאפשר את הפתרונות להתקרר לטמפרטורת החדר, בערך 1 h.הערה: שלב זה קודם denatures את ה-DNA ולאחר מכן מאפשרת הגדילים reanneal באופן אקראי כדי להפיק להקות heteroduplex אפשרי או לא תואם DNA כפול-strand המכיל פולימורפיזמים שנוצרו על-ידי CRISPR-מוטגנזה מכוונת ו לכן יש של שינו ניידות electrophoretic לעומת homoduplexes. המחזור האחרון של ה-PCR או כבש-מטה תוכנית ב- thermocycler יכול לשמש גם כדי reanneal47,מוצרים48, אך השימוש האמבט הרותח, תניב משופרות ברזולוציה של מוצרים heteroduplex. להוסיף 5 µL של 6 x הטעינה לצבוע (ראה טבלה של חומרים) ועד לפתרונות ה-PCR reannealed ביותר. הטיל לזיהוי/TBE 15% ג’ל באמצעות 30% לזיהוי (29:1). לאחר הגדיר הג’ל, מקם אותו לתוך מכשירים אלקטרופורזה עם TBE הפעלת מאגר. שימוש של P1000, נקה הבארות של נפולת כגון משקעי מלחים או ג’ל שברי כי יכול לחסום את הבארות על ידי בעדינות pipetting מאגר למעלה ולמטה לתוך הבארות מספר פעמים. עומס 500 ננוגרם של מוצרי ה-PCR reannealed, וכן טען פקד (דוגמה מדגים uninjected) לצד כל קבוצה של דגימות sgRNA. הפעל את הג’ל ב-150 V 2.5 h או עד החזית צבע היא בחלק התחתון של הג’ל. לדמיין את הלהקות בעזרת כתם חומצת גרעין (למשל, אתידיום ברומיד או SYBR ירוק (ראה טבלה של חומרים)). בדוק את תבנית הלהקה עבור כל פקד ובריכת המוזרק CRISPR של העוברים.הערה: המראה של מספר להקות לפעול לאט יותר ב- מוזרק לעומת מסלולים uninjected מצביע על היווצרות של מוצרים חדשניים heteroduplex (איור 4). הנוכחות של הרומן heteroduplex דנ א מציין כי indels נוצרו כתוצאה CRISPR-ההזרקה. הפחתה בעוצמת הלהקה homoduplex מוזרק פתרונות של 50% ומעלה מספיקה בדרך כלל את התוצאה מספקת germline שידור. בנוסף, להקות נוספות לפעמים ניתן לזהות את הדג uninjected, אין להתייחס להקות heteroduplex כאשר שנצפתה הדג מוזרק. לבחור את הזריקות עם חיתוך היעילות הגבוהה ביותר ביחס הפקד uninjected עבור כל מטרה; העוברים של זריקות אלה ניתן לגדל את הדג לחפש indels גורם codons עצירה מוקדמת.הערה: לצורך חיתוך יעיל ביותר (הפחתת בלהקה homoduplex באינטנסיביות כ > 50%), הקרנת דגים למבוגרים 20 – 30 צריך להספיק להשיג germline שידור.עבור sgRNAs לייצר פחות חיתוך, הדגים הבוגרים יותר עשוי להיות נחוץ כדי להגביר את הסבירות של זיהוי דגים כי התערוכה germline שידור של אללים ששונה המכיל codon עצירה מוקדמת. אם ויאסין היווצרות לא נצפית זה ייתכן שיהיה צורך לעצב מחדש את sgRNA לאזור אחר של הגן. אם אין היווצרות band heteroduplex הוא ציין, ייתכן השפלת sgRNA, איכות sgRNA צריך לאמת באמצעות ג’ל שתנן/עמוד. 5. זיהוי והתפשטות של קווי הנוק-אאוט כדי לזהות דג פוטנציאלי של האב המייסד, לבצע הזנב קליפים של הדג F0 למבוגרים (גדל כ 2.5-3 חודשים) כדי לזהות נוכחות של indels. עזים ומתנגד הדג מ מ 0.62 tricaine (ראה טבלה של חומרים), ואז להשתמש תער נקייה, חדה כדי להסיר כ 1/2-3/4 של סנפיר הזנב. למקם את הזנב µL 45 מ מ 50 NaOH, ולהחזיר את הדגים למיכל השחזור. לבצע את החילוץ gDNA המתואר (צעדים 4.2 – 4.4). ברגע הדג מתחדשת התנהגות שחייה רגילה, מניחים את הדג על זורמים מים המערכת עד אופי ויאסין מזוהה.הערה: חיוני כדי להבטיח כי דגים בודדים ניתנים לזיהוי, ניתן להתאים בהתאם לתוצאות של קליפים הזנב. כמתואר (שלבים 4.5-4.9), לבצע HMA gDNA קליפ זנב כדי לקבוע אם הדג שונה על ידי הזרקת CRISPR (איור 5). כדי לזהות דג מייסד, גזע המבוגרים כי התערוכה להקות heteroduplex זנב gDNA פראי-סוג דגים. לאסוף את העוברים ואגדל אותם ל- 72 hpf. -72 hpf, לאסוף 10 עוברי ומניחים כל העובר בצינור בודדים. מבצע החילוץ gDNA כמפורט לעיל (4.2 שלבים – 4.4) באמצעות µL 11.25 של 50 מ מ NaOH ו- 1.25 µL של 1 מ’ טריס pH = 8. חזור על ה-PCR ו אלקטרופורזה לזיהוי להקות heteroduplex כפי שתואר לעיל (שלבים 4.7-4.13) כדי לקבוע אם ויאסין אללים הועבר לדור הזה (איור 6). בהתבסס על השידור אחוז שנצפתה עוברי יחיד באמצעות את HMA, לגדול ממוצע של 20 – 30 עוברי השיג על ידי הצלב עבור כל CRISPR-קווים עניין לבגרות.הערה: מספר זה ייתכן עלה או ירד בהתאם התדירות של germline שידור. לבצע הזנב קליפים של הדג F1 למבוגרים כדי לזהות נוכחות של indels כפי שתואר (שלבים 5.1 – 5.2). כמתואר (שלבים 4.5 – 4.11), לבצע HMA gDNA קליפ זנב כדי לקבוע אם הדג נושאת ויאסין (איור 7). דגים מכילים להקה heteroduplex, להכין את ה-DNA רצף ניתוח. לבצע PCR באמצעות תחל חדש כדי להגביר את מוצר ה-PCR bp 300 – 600 ממורכז סביב האתר לחתוך. להשתמש ערכת טיהור PCR כדי לנקות את ה-DNA, elute 30 µL. לבדוק את הדנ א על ג’ל agarose כדי להבטיח להקה אחת קיים.הערה: כמה פסים heteroduplex עשויה להיות נוכח על הג’ל agarose ומופיע השמצות קטן או הלהקה כפול מעל המוצר PCR את הגודל הצפוי. אם מאבחנים indels אחד עד שלושה, רצף של מוצרים PCR באמצעות סנגר רצף ולקבוע את רצף ויאסין באמצעות הכלי של ביואינפורמטיקה49. אחרת, הקביעה של הרצף של מוצרים PCR מרובים באמצעות ניתוח המיתרים (ראה טבלה של חומרים) הוא חסכוני יותר. לקבוע אם codon עצירה מוקדמת התקבל על ידי ניתוח הרצף בעזרת כלי לביואינפורמטיקה (ראה טבלה של חומרים). מניחים את הדג המכיל אלל mutant הרצוי לתוך טנק חדש עם תוויות המתאימים. עיצוב PCR צבעי יסוד ויאסין מסוים אללים לצרכים genotyping בעתיד. אלה תחל עליו להקיף את רצף מוטציה, לא להגביר את רצף פראי-סוג. בצלב דג זברה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים ליצירת אוכלוסיה הפרדת שיכיל 25% הנוק-אאוט שורות.

Representative Results

גישות ניסיוניות שמתואר פרוטוקול זה מאפשר ייצור יעיל, חסכוני של דג זברה מעלף קווי בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. התוצאות הבאות נכללו במאמר זה כדי להקל על פרשנות ופתרון של התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה. בעקבות הפקה מוצלחת microinjection של CRISPR-ריאגנטים, ניתן לנתח את העוברים דג זברה פנוטיפים עבירה ועל היווצרות ויאסין באמצעות HMA. פקד מועיל להמחיש את ההצלחה של הניסוי CRISPR הוא השימוש sgRNA שמתואר בשלב 1.5 למקד את הגן לייצור פיגמנטים tyrosinase. היווצרות ויאסין הנוצרות על-ידי Cas9- tyrosinase גורמת לאובדן של פיגמנטציה, הוא הבקיע בקלות על ידי 48 hpf (איור 1). פקד מועיל אחר כדי לוודא את הכנת CRISPR ריאגנטים עבור הזרקה הוכתרה בהצלחה, רק כדי לאשר את באורך מלא (120 nt) sgRNA יש כבר מסונתז באמצעות ג’ל לזיהוי denaturing (איור 2, ליין 1 ו- 2). אם כבר פחתה את הרנ א זה עשוי להיראות כמו כתם, לדוגמה 3 ליין (איור 2) מראה RNA מפורק לא מתאים הזרקת. כדי לנתח את תדירות היווצרות ויאסין של גנים ממוקד על ידי CRISPR-Cas9 אשר התוצאה אינה עבירה פנוטיפים כגון tyrosinase, ניתוח HMA היא שיטה פשוטה ואמינה. sgRNA/Cas9 מוזרק עוברי נותחה באמצעות תוצאות HMA היווצרות של להקות heteroduplex ולאחר הפחתת עוצמת של הלהקה homoduplex (איור 4). הנוכחות של heteroduplex להקות נוספות מנוצל ב פרוטוקול זה כדי לזהות פוטנציאל דגים מייסד מן העוברים microinjected ובתור מבוגרים (איור 4 , איור 5), כדי לנתח את יעילות העברת germline מייסד ( איור 6), וכדי לוודא הימצאות ויאסין בדג משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים F1 (איור 7). הדג משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים המכילים ויאסין הם מועמדים המיתרים כדי לזהות את אופי ויאסין וכדי לקבוע אם codon עצירה מוקדמת קיים באזור קידוד של הגן היעד. איור 1 : דג זברה עוברי התערוכה פגם פיגמנט כאשר הזריקו sgRNA מיקוד tyrosinase בשלב אחד-תא. (א) פראי-סוג, uninjected העובר ב 48 hpf ו- (B) מוזרק העובר ב 48 hpf. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : במבחנה שעתוק של sgRNA באמצעות ערכת סינתזה. Oligos היו מסונתז באמצעות במבחנה שעתוק לפי ההוראות ערכת סינתזה sgRNA. 500 ננוגרם של RNA היה לרוץ על ג’ל שתנן/עמוד כמתואר. sgRNA טעון מסלולים 1 ו- 2 מראה להקה התואם באורך מלא, RNA nt 120 ללא פגע. SgRNA בנתיב 3 מציג מדגם ה-RNA מפורק לא מתאים הזרקת. איור 3 : השוואה של הבריאות של עוברי hpf מוזרק 24. העובר החי (A) שפותחה כדי 24 hpf, בקלות נבדל העובר זה יש בוטלה פיתוח (B). עוברי דומים (B) או באופן דרסטי לשנות תכונות (a), כגון עקמומיות בעמוד השדרה או שינו את הראש, התפתחות העין יש להסיר מן המנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : Heteroduplex assay ניידות של sgRNA-Cas9 microinjected דג זברה עוברי. בריכות של עוברי 5 עבור דגימה שנאספו-72 hpf ו gDNA נעקר. Heteroduplex ניתוח בוצע כמתואר, הדגימות היו מפוצצות באופן שווה 500 ננוגרם של ה-DNA. נתיבים: M = סמן bp 100; 1 = שליטה uninjected; 2 = הזרקה מדגם 1; 3 = הזרקה מדגם 2. צפוי במידה = 98 bp. איור 5 : Heteroduplex assay ניידות של gDNA מופק הזנב של דג זברה בוגרת הזרקת CRISPR. עוברים הוזרקו עם sgRNA ו Cas9 חלבון גדלו לבגרות (3 חודשים). דגים B ו- C בנספח heteroduplex להקות, שנולדו לאחר מכן כדי לזהות germline ששודרו indels; דג שימש לא חשפה כי היא לא הכריזה להקת heteroduplex חיובי. נתיבים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2 = דג; 3 = דגים ב’; 4 = דג ג צפוי במידה = 98 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6 : Heteroduplex assay ניידות של אחד העוברים שנוצרו על-ידי גידול דג המוזרק F0 CRISPR כדי דג פראי-סוג כדי לזהות germline ששודרו indels. דג זברה היו הזדווגו, העוברים F1 פותח עבור עוברי יחיד ה 72 שנאספו, ניתוח heteroduplex שבוצעה כמתואר. נתיבים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2-10 = של העובר F1 יחיד לכל ליין. ג’ל זה מראה כי 7 מתוך 10 עוברי להראות להקה heteroduplex חיובית, המציינת את קצב שידור germline של 70% ויאסין. צפוי במידה = 98 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 7 : Heteroduplex assay ניידות של קליפים זנב של דג זברה F1 למבוגרים. דגים F1 למבוגרים היו שבוים על ידי HMA לזיהוי indels. דג זה הציג להקה heteroduplex חיובי היו PCR מוגבר וזקוק לניתוח רצף רחב כדי לקבוע את טיב המוטציה. (א) מסלולים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2 = דגים (4 bp מחיקה, אי התאמה 1 bp). דגים (B) F1 אלה זוהו המייסד באותו, ועדיין להראות שונה heteroduplex תכנים, המציין germline שידור של אללים מרובים ששונה מ יסוד בודד. נתיבים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2 = דגים B (הכניסה bp 4, 7 אי-התאמה של bp), 3 = דגים C (מחיקה bp 4, 4 אי-התאמה של bp). כל אחד indels אלה יצרו codon עצירה מוקדמת של קידוד רצף הגן היעד, כפי שנקבע על ידי המיתרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ג’ין הסתרה במערכת מודל חוליות דג זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. מספר פרוטוקולים תוארו קודם לכן לבצע הנדסה הגנום בתיווך CRISPR דג זברה15,25,26,50,51,52. פרוטוקול זה מתבסס על המאמצים הקודמים על-ידי שילוב של מספר טכניקות ניסיוני פשוטה אך עקבי reproducibly, בפרט HMA, המיתרים של מספר דגים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, כדי ליצור ישירה חסכן, והפרוטוקול השפעול חזקים עבור מוטגנזה מכוונת בתיווך CRISPR ב דג זברה המתאים עבור מעבדות מאויש עם כוח אדם באמצעות מגוון של הכשרה, ניסיון, כמו גם מעבדות.

המלצות על עיצוב, סינתזה של מדריך ש-rnas כלולים פרוטוקול זה. שיקול מרכזי במדריך עיצוב ה-RNA הוא צמצום תופעות מחוץ-יעד. מספר אלגוריתמים חיזוי פותחו כדי לאפשר CRISPR-למשתמשים גישה לכלים חישוב עם ממשקים גרפי ידידותי למשתמש לחזות גם את הפעילות של המדריך על המטרה וגם את הסיכוי של חופש-יעד אפקטים34, 35,36. יתרון מסוים של מערכת דג זברה הוא הוריד שערי תופעות רחוק ממסלול הנחיתה-כי Cas9 מוזרק העוברים ולכן הביטוי ארעי, אשר הוכח בעכברים כתוצאה מכך ירד את המטרה אפקטים53. ובכל זאת, את המטרה אפקטים הוכחו להופיע אצל דג זברה54. דרך אחת כדי לשלוט לאפקטים חופש-יעד היא דג זברה מייסד פנוטיפ, שנוצרו על ידי שני RNAs מדריך עצמאי שמכוון אותו גן, מדריכים אלה יהיה קרוב לוודאי להשפיע על אתרים הנחה-יעד שונים. שיטה חלופית כדי למזער את ההשפעות את המטרה המתואר לא ב פרוטוקול זה הוא השימוש Cas9 מוטציה אשר יוצר מעברי חוט יחיד על המטרה ה-DNA, אשר תוקנו עם יעילות גבוהה. זיווג ניקס דנ א בתוך הקרבה של אחד לשני כי הם משלימים את ההפך קווצות תוצאות במבנה ויאסין יעיל-מיקומה הרצוי, ממזער את המטרה אפקטים55,56.

בנוסף תעריפים שונים של תופעות מחוץ-יעד, sgRNAs שונים יכולים להיות שונים שערי מוטגנזה מכוונת של היעד הרצוי57,58,59. פרוטוקול זה משתמש HMA כדי לנתח את יעילותו של מוטגנזה מכוונת של sgRNA נתון באמצעות heteroduplex הלהקה היווצרות33,40. להקות Heteroduplex נוצרות על ידי הכלאה של גדילי DNA שנוצר על-ידי ה-PCR מכילים אי-התאמות, והוא יכול בקלות לפתור באמצעות אלקטרופורזה בג’ל. בניגוד לשיטות אחרות בשימוש נפוץ כדי למדוד את היווצרות ויאסין, כגון endonuclease T7 assay או ברזולוציה גבוהה להמיס ניתוח25,26, HMA אינה דורשת אנזים יקר לחתוך DNA שאינם תואמים, ואין צורך ניתוח מורכב של ה-PCR להמיס עקומות. חשוב לציין, שימוש HMA לאימות שיעור גבוה של היווצרות ויאסין באוכלוסייה מוזרק גם מאפשר החוקר לצמצם את מספר הדגים הדרושים לייצור עוקבות של קווים הנוק-אאוט, המפחיתה את העלות לזיהוי מוטציה עם התכונות הרצויות.

הקלות היחסית יצירת מבוססי CRISPR indels מאפשר יצירה של אללים מרובים של גנים מרובים בבת אחת. תוכנה מבוססת אינטרנט זמין עבור ניתוח של מוטציות יחידה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים דגים באמצעות סנגר רצף של מוצרי ה-PCR49. במקרה שבו שלושה או יותר CRISPR-מוטציה אללים מנותחים, המיתרים לאפיין את אופי ויאסין הוא כנראה להיות עלות יותר אפקטיבי כדי לאפיין את אופי ויאסין כמו גישה זו מאפשרת מאגר של עד 50 אללים שונים כדי להיות מאופיין ב o nce61,60,(ראה טבלה של חומרים)62. כלכלת בקנה מידה כזה סביר להניח יהיה שימושי במיוחד באווירה מעבדה לתואר ראשון.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק הנחיות צעד אחר צעד ליצירת reproducibly באיכות גבוהה CRISPR ריאגנטים (ב בפרט, sgRNA) כך פחות דגים למבוגרים צריך להיות שנוצרו וניתח בהצלחה לזהות את אללים mutant הריבית, אשר גם מפחית את זמן ועלות של יצירת הקווים הרצויים. חשוב לציין, פרוטוקול זה תוכנן כך זה יכול להיות מיושם על ידי מעבדות עם משאבים מוגבלים כדי לייצר דג זברה מוטנטים באופן סביר. יתר על כן, מצאנו כי גישה זו מתאימה לתלמידי, ובכך מרחיב את ההזדמנויות עבור חינוך והכשרה של סטודנטים לתואר ראשון המעוניינים התנסות בעריכת הגנום מבוסס CRISPR.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R21CA182197 על חיילים), ראלף וו ואמון גרייס מ שוואלטר מחקר, ועל -ידי את פרדו אגרונומיה והסיומת עבור תוכנית לפיתוח כלכלי (AgSEED). סאנגר רצף נתונים נרכשו על ידי המתקן Purdue גנומיקה הליבה תומכת P30 CA023168. מרי Witucki נתמכה על ידי המרכז האוניברסיטאי Purdue עבור סרטן מחקר הקיץ לתואר ראשון תכנית המחקר נתמך על ידי האגודה סרטן במחוז קארול. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. אנו מודים בנימין קרטר, אלן דנינג, טיילור סבתו על מתן משוב ביקורתי כתב היד. אנו מודים למחלקה לביוכימיה לתמיכה של עבודה זו, המרכז לחקר דג זברה באוניברסיטת פורדו בהקדשה שלהם טיפול, רווחה של המושבה דג זברה. לבסוף אנו מודים המתקן הליבה גנומיקה פרדו, תרומות של פיליפ סן מיגל לגבי השירותים המיתרים.

Materials

CRISPOR sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/
Breaking-Cas sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChop sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3 PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free technique http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free water Any brand Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.
Rnase-free ethanol Any brand Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.
Cas9 Protein PNA Bio CP01 Cas9 protein with nuclear localization signal.
Target specific oligos Integrated DNA Technologies (IDT) Synthesize guide RNAs.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.
EnGen sgRNA Synthesis Kit New England BioLabs E3322 In vitro transccribe guide RNAs.
10X TBE Thermo Fisher B52 RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.
6X Load Dye New England BioLabs B7025S Loading DNA for electropheresis.
5M Ammonium acetate Thermo Fisher AM9071 Clean up reagent for purification of guide RNAs.
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any brand Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.
Nuclease-free Water Any brand For synthesis and purification of guide RNAs.
RNase away Thermo Fisher 10328011 Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.
DNA Ladder, 100 bp New England BioLabs N0467S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
DNA Ladder, 1 kb New England BioLabs N0552S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
RNA Ladder New England BioLabs N0364S Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized
TEMED Thermo Fisher 17919 Casting polyacrylamide gel.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Casting polyacrylamide gel.
40% Polyacrylamide (19:1) BioRad 161-0154 Casting denaturing polyacrylamide gel.
Urea Sigma-Aldrich U5378-100G Casting denaturing polyacrylamide gel.
RNA Gel Loading Dye (2x) Thermo Fisher R0641 Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510-10ML Visualization of nucleic acids.
SYBER Green Thermo Fisher S7563 Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.
Microcentrifuge Eppendorf 5424 RNA clean up, PCR purification.
MyTaq Polymerase Bioline BIO-21105 For amplification of DNA using PCR.
Thermocycler Any brand PCR amplification.
Spectrophotometer Any brand NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.
E3 embryo media Made in house Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140 Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish Thermo Fisher FB0875711Z Store embryos, cast injection plate.
Agarose Denville CA3510-8 Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold Adaptive Science Tools TU-1 To create wells to hold embryos during injection.
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290  Dye for visualization of injection.
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5904-5ML To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes Any brand Moving embryos.
Razor blade Thermo Fisher 11295-10 Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator Any brand Maintaining embryos at 28.5 oC.
Verticle pipette puller David Kopf Instruments 700C Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes Sutter Instruments BF100-58-10 Geneate needles for injection.
Microloader tips Eppendorf 930001007 Load solution into injection needles.
Microinjector World Precision Instruments PV 820 Injecting embryos.
Disecting microscope Leica Injecting embryos.
30% Polyacylamide (29:1) BioRad 161-0156 Heteroduplex gel casting.
MS-222 (Tricaine) Sigma-Aldrich A-5040 Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Microwave Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Scale Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Gloves Any brand For all aspects of the protocol.
N2 Any brand To expell liquid from the capillary for embryo injection.
1,000 µL  tips Any brand For all aspects of the protocol.
200 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
10 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
PCR strip tubes Any brand For all aspects of the protocol.
Micropipettes Any brand For all aspects of the protocol.
NGS Sequencing platform: Wideseq If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).
Software for sequence analysis For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software for sequence analysis SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
  3. Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
  4. Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  5. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
  6. Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061 (2013).
  7. Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process?. PLoS Genet. 10 (1), e1004086 (2014).
  8. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  10. Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
  11. Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
  12. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
  13. Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
  14. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141 (2013).
  15. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
  18. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  19. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  20. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  21. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  22. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  23. Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
  24. Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547 (2016).
  25. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282 (2014).
  26. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  27. Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
  28. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
  29. Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
  30. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555 (2016).
  31. Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
  32. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186 (2014).
  33. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  34. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  35. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
  36. Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
  37. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  38. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  39. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  40. Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
  41. Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
  42. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319 (2015).
  43. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
  44. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  45. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  46. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
  47. Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
  48. Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
  49. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  50. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  51. Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
  52. Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
  53. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
  54. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  55. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  56. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  57. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  58. Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
  59. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
  60. Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002 (2014).
  61. Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
  62. Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).

Tags

CRISPR/Cas9Gene KnockoutDanio RerioZebrafishTargeted Genome EditingIn Vitro TranscriptionSgRNAAmmonium Acetate PrecipitationEthanol PrecipitationRNA Purification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. J. Vis. Exp. (138), e56969, doi:10.3791/56969 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image