Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.
Charakterisierung von gruppierten, regelmäßig dazwischen, werden kurze, palindromische (CRISPR) System von Streptococcus Pyogenes ermöglichte die Entwicklung einer anpassbaren Plattform schnell gen Änderungen in einer Vielzahl von generieren Organismen, einschließlich Zebrafisch. CRISPR-basierte Genom-Bearbeitung verwendet eine einzelne Guide RNA (SgRNA) Ziel einer CRISPR-assoziierten (Cas)-Endonuklease genomische DNA (gDNA) Ziel von Interesse, wo die Cas-Endonuklease erzeugt eine Doppel-Strang-Pause (DSB). Reparatur von DSB durch fehleranfällige Mechanismen führen zu Einfügungen oder Löschungen (Indels). Dadurch können Frameshift-Mutationen, die oft ein vorzeitiges Stopcodon innerhalb der kodierenden Sequenz, wodurch ein Protein-Null-Allel einführen. CRISPR-basierte Genom Engineering erfordert nur wenige molekularen Komponenten und ist leicht durch Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen eingeführt. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden CRISPR Reagenzien für Zebrafisch Mikroinjektion zu generieren und Fische ausstellenden Germline Übertragung von CRISPR-modifizierte Gene identifizieren. Diese Methoden umfassen die in Vitro Transkription von SgRNAs, Mikroinjektion CRISPR Reagenzien, Identifizierung der Indels induziert in der Ziel-Site mit einer PCR-basierten Methode ein Heteroduplex Mobility Assay (HMA) und Charakterisierung der Indels genannt mit einem niedrigen Durchsatz und eine leistungsfähige Next Generation Sequencing (NGS)-basierenden Ansatz, die mehrere PCR-Produkte von heterozygoten Fisch gesammelt analysieren können. Dieses Protokoll wird optimiert, um die Anzahl der Fische erforderlich und welche Ausrüstung benötigt, um die Analysen zu minimieren. Darüber hinaus ist dieses Protokoll so konzipiert, zugänglich für den Einsatz von Labor-Personal von allen Ebenen der Erfahrung unter anderem Studenten, ermöglicht dieses mächtige Werkzeug jede Forschungsgruppe Interesse CRISPR-basierte wirtschaftlich eingesetzt werden Genomic Änderung im Zebrafisch.
Die Erhaltung der molekularen Maschinerie in Eukaryoten zugrunde liegt die Macht der Verwendung Modellorganismen für die Forschung. Viele dieser Modellsysteme erleichtern die Verwendung von Reverse-gentechnische Ansätze wie gezielte gen Knockouts, den Beitrag eines gen-Produktes um einen biologischen oder Krankheit Prozess zu charakterisieren. Gen Störung Techniken in Organismen wie dem Zebrafisch haben sich historisch auf gezieltes einbringen von Frameshift-Mutationen verlassen, die durch ungenaue Reparatur von DSB1,2entstehen. Wenn ein DSB in das Genom eingebracht wird, ist die DNA-Läsion durch einen der beiden Wege, die universell in fast allen Arten von Zellen und Organismen vorhanden sind repariert: nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) und unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR)3,4 . Die Ungenauigkeit der NHEJ Maschinen produziert häufig Indels von verschiedenen Längen5,6,7,8,9. Einführung von Frameshift-Mutationen in der kodierenden Sequenz eines Gens kann ein vorzeitiges Stopcodon produzieren, die oft das Gen nicht funktionsfähig macht.
Frühen Genom engineering Strategien im Zebrafisch Förderung Indels enthalten Meganucleases, Zinkfinger-Nukleasen und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen, die DNA-Protein Interaktionen um eine Nuclease auf einen bestimmten genomische gezielt genutzt Ziel, wo es ein DSB10,11,12,13,14,15eingeführt. Diese Technologien sind jedoch oft schwierig, gelten aufgrund der aufwändige und komplexe Technik musste eine Nuklease zu generieren, die die DNA Reihenfolge des Interesses richtet sich an. Im Gegensatz zu bisherigen Strategien verlassen CRISPR-basierte gen bearbeiten nicht auf Protein-DNA-Wechselwirkungen für die Zielgruppenadressierung. Stattdessen CRISPR-assoziierten (Cas)-Endonuklease über eine RNA-Leitfaden richtet sich das Nukleotid base pairing Interaktionen verwendet, um gezielt eine genomische Website Interesse16,17,18,19 ,20,21. Aufgrund der Einfachheit der Gestaltung einer RNS ist Guide mit der gewünschten Basis Paarung Interaktionen für die Zielgruppenadressierung es relativ einfach, die Cas-Endonuklease an den gewünschten Ort zu richten. Typ II CRISPR-System wurde vor allem weit entwickelt für Genom-editing-Anwendungen durch mehrere vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich der Verwendung von einem einzigen multidomain Cas-Nuklease (Cas9), die Interaktion mit DNA Endonuklease Aktivität stimulieren erfordert und von einer einzigen Führer RNS (SgRNA) nutzen, um es auf den cognate DNA-Sequenz18Ziel. Voraussetzungen die Sequenz für das targeting von verwandten SgRNA sind gut verstanden19, und die gewünschte SgRNA wird leicht durch in Vitro Transkription generiert. Die Einfachheit und Robustheit der CRISPR/Cas9 Ansatz erleichtert die gezielte gentechnische Veränderung im Zebrafisch und eine Vielzahl von anderen Organismen.
Die verbesserte Fähigkeit zu übernehmen hat gezielte Genom-Bearbeitung im Zebrafisch als Folge entwickeln CRISPR-basierte Reagenzien erheblich erhöht die Möglichkeit, Prozesse Sinnbild für Wirbeltiere Organismen wie Entwicklung der das zentrale Nervensystem zu studieren System. Das Zebrafish Genom enthält Orthologe von 70 % der Protein-kodierenden Gene im menschlichen Genom sowie 84 % der Gene im Zusammenhang mit Krankheiten im Menschen22gefunden. Zebrafisch Entwicklung weist mehrere wichtige Eigenschaften, die seine Verwendung in umgekehrter genetische Studien zu verbessern: die Embryonen sind in große Gelege gelegt, nach außen zu entwickeln, von der Mutter, so dass sie offen für genetische Manipulation durch Mikroinjektion und Erwachsenen Zebrafisch geschlechtsreif mit 3 Monaten, so dass für die rasche Ausbreitung der gewünschten Linien23.
Zahlreiche Protokolle stehen zur Verfügung, die beschreiben eine Vielzahl von Ansätzen zu generieren und zu identifizieren CRISPR-abgeleitete Indels im Zebrafisch24,25,26,27,28,29 ,30,31. Aber viele dieser Verfahren sind zeitintensiv, benötigen Zugriff auf teure Ausrüstung und können schwierig sein, für Labors mit begrenzten Kompetenzen. Die hier beschriebenen Schritte bieten eine einfache, robuste und wirtschaftliche CRISPR/Cas9-Strategie zu Ingenieur Zebrafisch ko-Linien. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines hocheffizienten Kit SgRNAs mit DNA-Oligonukleotide (Oligos) zu synthetisieren, ähnlich wie andere Ansätze, die zuvor beschriebenen32. Das beschriebene Protokoll umfasst zwei Schritte insbesondere, die Analyse der CRISPR mutiert erheblich vereinfachen: Schritt für Schritt Verwendung der PCR-basierter HMA33 , leicht feststellen, das Vorhandensein von Genom-Modifikationen und Sequenzierung Analyse der heterozygot Zebrafisch, schnell und einfach die Natur mehrere Indels auf wirtschaftliche Weise zu bestimmen. Darüber hinaus sind schrittweise Anleitungen für robuste Auswahl, zuverlässige Produktion und Injektion des Guide RNAs enthalten. Die hier angegebenen Schritte veranschaulichen eine robustere, relativ kostengünstige Protokoll, die Laborpersonal mit ein Spektrum an Fachwissen zur Identifizierung des Gens Knockouts im Zebrafisch beitragen kann.
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Gen Knockouts im Zebrafisch vertebrate Modellsystem CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Reihe von Protokollen wurden zuvor beschrieben CRISPR-vermittelten Genom Engineering im Zebrafisch15,25,26,50,51,52durchzuführen. Dieses Protokoll baut auf bisherigen Bemühungen durch die Kombination von eine Reihe von einfachen aber reproduzierbar konsequente experimentelle Techniken, insbesondere HMA und NGS mehrerer heterozygot Fisch, erstelle ich eine einfache, wirtschaftliche, und experimentell robuste Protokoll für CRISPR-vermittelten Mutagenese im Zebrafisch, die geeignet für Labore mit Personal mit einer Reihe von Ausbildung und Erfahrung, sowie die Lehre Labors ausgestattet ist.
Empfehlungen für Design und die Synthese des Guide RNAs sind in diesem Protokoll enthalten. Eine wichtige Überlegung im Guide RNA-Design ist die Minimierung der Ziel-Effekte. Mehrere Vorhersage Algorithmen wurden entwickelt, um Benutzern CRISPR-Berechnung Werkzeuge mit benutzerfreundlichen grafischen Schnittstellen zugreifen, die Vorhersagen, sowohl die Aktivität des Handbuchs auf Ziel und die Chance des Ziel-Effekte34, 35,36. Ein besonderen Vorteil des Zebrafisch-Systems ist gesenkten Preise der Ziel-Effekte, weil die Cas9 in die Embryonen injiziert wird und daher Ausdruck flüchtig ist, die bei Mäusen nachweislich zu einer verminderten Ziel Effekte53führen. Dennoch wurden Ziel Effekte nachgewiesen, im Zebrafisch54auftreten. Eine Möglichkeit zur Steuerung für Ziel-Effekte besteht darin Phänotyp Gründer Zebrafisch, die durch zwei unabhängige Guide RNAs, die auf das gleiche gen erzeugt worden sein, da diese Führungen wäre sehr wahrscheinlich, dass verschiedene Ziel-Websites betreffen. Eine alternative Methode zum Ziel Auswirkungen zu minimieren, die nicht in diesem Protokoll beschrieben wird ist die Verwendung von einem mutierten Cas9, die Einzelstrang Pausen am Ziel DNA, erzeugt, die mit hohem Wirkungsgrad repariert werden. Paarung DNA Kerben in der Nähe von einander, die das Gegenteil ergänzen Stränge führt effektiv Indel Bildung an den gewünschten Ort und Ziel-Effekte55,56minimiert.
Zusätzlich verschiedene Sätze von Ziel-Effekte, können verschiedene SgRNAs unterschiedliche Mutagenese der gewünschte Ziel57,58,59haben. Dieses Protokoll verwendet HMA zur Analyse der Effizienz der Mutagenese von einer bestimmten SgRNA mit Heteroduplex Band Bildung33,40. Heteroduplex Bänder entstehen durch Hybridisierung des PCR-generierte DNA-Stränge, die Abweichungen enthalten, und können mit Gelelektrophorese leicht behoben werden. Im Gegensatz zu anderen üblichen Methoden, Indel Bildung zu messen wie die T7-Endonuklease Assay oder hochauflösende schmelzen Analyse25,26, HMA erfordert keine teure Enzym nicht übereinstimmende DNA schneiden, und erfordert keine komplizierte Analyse von PCR schmelzen Kurven. Wichtig ist, ermöglicht mit HMA, um hohe Raten von Indel Bildung in der injizierten Bevölkerung zu überprüfen auch die Ermittler zu minimieren die Anzahl der Fische für die nachfolgende Produktion Knock-out-Linien, das reduziert die Kosten für die Ermittlung einer Mutation mit der gewünschten Eigenschaften.
Die relative Leichtigkeit erzeugen CRISPR-basierte Indels ermöglicht die Erstellung von Multiple Allele mehrere Gene auf einmal. Web-basierte Software ist verfügbar für die Analyse der einzelnen Mutationen von heterozygoten Fische mit Sanger der PCR Produkte49sequenzieren. In dem Fall, wo drei oder mehr CRISPR-mutierten Allele analysiert werden, ist NGS, die Natur der Indel zu charakterisieren wahrscheinlich kostengünstiger, die Art der Indel als dieser Ansatz charakterisieren sein einen Pool von bis zu 50 verschiedene Allele bei o charakterisiert werden können NCE (siehe Tabelle der Materialien)60,61,62. Diese Größenvorteile wäre wahrscheinlich besonders nützlich in einer grundständigen Laborumgebung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dieses Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Erzeugung von reproduzierbar hochwertige CRISPR-Reagenzien (insbesondere SgRNA), so dass weniger Erwachsene Fische müssen erstellt und analysiert, um erfolgreich zu identifizieren, die mutierten Allele von Interesse, die auch reduziert den Zeit- und Kostenaufwand die gewünschten Linien zu erzeugen. Wichtig ist, hat dieses Protokoll so konzipiert, dass es von Labors mit begrenzten Ressourcen, mutierten Zebrafisch auf erschwingliche Weise zu produzieren angewendet werden kann. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass dieser Ansatz eignet sich für Studenten und damit die Möglichkeiten zur aus- und Weiterbildung von Studenten praktische Erfahrungen im Erbgut CRISPR-basierte Bearbeitung interessiert baut.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (R21CA182197, j.o.), Ralph W. und Grace M. Showalter Research Trust, und durch die Purdue Agrarwissenschaft und Erweiterung für wirtschaftliche Entwicklung (AgSEED) Programm. Sanger-Sequenzierung-Daten wurden von der Purdue Genomics Core Facility unterstützt durch P30 CA023168 erworben. Mary Witucki wurde von der Purdue University Center für Cancer Research Sommer Undergraduate Research Program unterstützt durch die Carroll County Cancer Association unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir danken Benjamin Carter, Ellen Denning und Taylor Sabato für kritische Rückmeldungen auf das Manuskript. Wir danken der Fakultät für Biochemie für die Unterstützung dieser Arbeit und dem Center for Zebrafisch-Forschung an der Purdue University für ihr Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Zu guter Letzt danken wir der Purdue Genomics Core Facility und Beiträge von Phillip San Miguel in Bezug auf die NGS-Dienste.
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |