Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.
Caractérisation de l’ordonné en clusters, régulièrement espacées, courtes, palindrome répéter (CRISPR) système de Streptococcus pyogenes a permis le développement d’une plate-forme personnalisable pour générer rapidement des modifications du gène dans une grande variété de organismes, y compris le poisson-zèbre. Axée sur les CRISPR génome édition utilise un seul guide RNA (sgRNA) afin de cibler une endonucléase associée à CRISPR (Cas) à une cible d’ADN (génomique) génomique d’intérêt, où l’endonucléase de Cas génère un saut double-brin (DSB). Réparation des CDB de plomb mécanismes sujette aux insertions ou suppressions (indels). Cela peut provoquer des mutations de déphasage qui présentent souvent un codon d’arrêt prématuré au sein de la séquence codante, créant ainsi un allèle de protéine null. Ingénierie de base CRISPR génome nécessite seulement quelques composants moléculaires et est facilement introduit dans des embryons de poisson-zèbre par microinjection. Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour générer des réactifs CRISPR pour le poisson-zèbre microinjection et d’identifier les poissons présentant des cellules germinales transmission des gènes modifiés CRISPR. Ces méthodes incluent la transcription in vitro de sgRNAs, microinjection de réactifs CRISPR, identification des indels induit sur le site de cible en utilisant une méthode basée sur le PCR appelée une analyse de mobilité hétéroduplex (HMA) et la caractérisation de l’indels en utilisant un débit faible et un séquençage puissant de prochaine génération (NGS)-basé d’approche qui permet d’analyser plusieurs produits PCR provenant de poissons hétérozygotes. Ce protocole est simplifié afin de minimiser le nombre de poissons nécessaires tant les types d’équipement nécessaire pour effectuer les analyses. En outre, ce protocole est conçu pour être prête pour utilisation en laboratoire personnel de tous niveaux d’expérience, y compris les étudiants de premier cycle, permettant à ce puissant outil devant être économiquement utilisés par les groupes de recherche intéressés dans l’exercice de base CRISPR modifications génomiques chez le poisson zèbre.
La conservation des machines moléculaires dans les eukaryotes sous-tend le pouvoir d’utiliser des organismes modèles pour la recherche. Bon nombre de ces systèmes modèles facilitent l’utilisation d’une approche génétique inverse comme débouchures de gène ciblé pour caractériser la contribution du produit d’un gène à un processus biologique ou d’une maladie d’intérêt. Techniques de perturbation de gène dans les organismes comme le poisson-zèbre ont historiquement invoqué ciblée introduction de mutations de déphasage qui résultent de réparation imprécise de la CDB1,2. Lorsqu’un ORD est introduit dans le génome, la lésion de l’ADN est réparée par l’une des deux voies qui sont universellement présents dans presque tous les types de cellules et organismes : fin non homologue rejoindre (NHEJ) et axés sur l’homologie réparation (HDR)3,4 . Le caractère imprécis de la machinerie NHEJ produit fréquemment indels diverses longueurs5,6,7,8,9. Introduction de mutations de déphasage dans la séquence codante d’un gène peut produire un codon stop prématuré, qui rend souvent le gène ne fonctionne pas.
Stratégies de génie précoce du génome chez le poisson zèbre pour promouvoir les indels incluent méganucléases, nucléases de doigts de zinc et nucléases d’effecteur comme activateur de transcription, qui utilisé interactions ADN-protéines pour cibler une nucléase à un particulier en génomique cible, où il introduit un ORD10,11,12,13,14,15. Cependant, ces technologies sont souvent difficiles à appliquer en raison de l’ingénierie laborieuse et complexe, nécessaire pour générer une nucléase qui cible la séquence d’ADN d’intérêt. Contrairement aux stratégies antérieures, modification génique à base CRISPR ne repose pas sur des interactions protéine-ADN pour le ciblage. Au lieu de cela, l’endonucléase associée à CRISPR (Cas) est dirigée par un guide de RNA qui utilise des nucléotides à base de couplage des interactions de cibler un site génomique d’intérêt16,17,18,19 ,20,21. En raison de la simplicité de la conception d’un ARN guide avec la base désirée interactions pour cibler l’appariement est relativement facile de cibler l’endonucléase de Cas au locus désiré. Le type II CRISPR système en particulier largement développé pour les applications d’édition en raison de plusieurs caractéristiques avantageuses, y compris l’utilisation d’une nucléase de Cas multidomaine unique (Cas9) nécessitant une interaction avec l’ADN pour stimuler l’activité endonucléasique génome et l’utilisation d’un seul guide ARN (sgRNA) à cibler à l’apparenté de séquence ADN18. Les exigences de la séquence nécessaires pour le ciblage de la sgRNA apparenté sont bien compris19, et le sgRNA désiré est facilement générée par in vitro de transcription. La simplicité et la robustesse de l’approche CRISPR/Cas9 facilite grandement la modification génétique ciblée dans le poisson-zèbre et une grande variété d’autres organismes.
La capacité accrue à entreprendre génome ciblé d’édition chez le poisson zèbre grâce à l’élaboration des réactifs à base de CRISPR a significativement augmenté la possibilité d’étudier les processus emblématiques d’organismes vertébrés tels que le développement du nerveux central système. Le poisson-zèbre génome contient orthologues de 70 % des gènes codant pour des protéines trouvées dans le génome humain ainsi que 84 % des gènes liés aux maladies chez les humains,22. Développement du poisson zèbre présente plusieurs qualités principales d’améliorer son utilisation dans les études de génétique inverses : les embryons sont déposés dans les grandes griffes, développer à l’extérieur de la mère, rendant la manipulation se prête à la génétique par microinjection et poisson-zèbre adulte maturité sexuelle à 3 mois, permettant une rapide propagation de lignes souhaitées,23.
Il existe plusieurs protocoles qui décrivent diverses approches pour générer et identifier les indels CRISPR dérivé dans le poisson-zèbre24,25,26,27,28,29 ,30,31. Cependant, beaucoup de ces procédures sont temps intensif, doivent avoir accès à des équipements coûteux et peuvent être difficile pour les laboratoires ayant une expertise limitée. Les étapes décrites dans la présente fournissent une simple, robuste et économique CRISPR Cas9-stratégie/ingénieur zebrafish knockout lignes. Ce protocole décrit l’utilisation d’un kit très efficace pour synthétiser sgRNAs utilisant des oligonucléotides d’ADN (oligos), semblable aux autres approches qui ont été précédemment décrit32. Le protocole décrit comprend deux étapes en particulier qui simplifient grandement l’analyse de lignées CRISPR muté : utilisation étape par étape du HMA basées sur la PCR33 pour déterminer facilement la présence de modifications du génome et analyse de la séquence de poisson-zèbre hétérozygote pour rapidement et facilement déterminer la nature des indels multiples de façon économique. En outre, des instructions sont incluses pour sélection robuste, production fiable et l’injection du guide RNAs. La procédure décrite ici illustre un protocole robuste et relativement peu coûteux qui permet au personnel de laboratoire avec un éventail de compétences contribuer à l’identification des débouchures de gènes chez le poisson zèbre.
Ce protocole décrit la production de débouchures de gène dans le système de vertébrés modèle poisson zèbre utilisant la technologie CRISPR-Cas9. Un certain nombre de protocoles ont été décrits précédemment pour entreprendre le génie de génome induite par CRISPR zebrafish15,25,26,50,51,52. Ce protocole s’appuie sur des efforts antérieurs en combinant un certain nombre de techniques expérimentales simples mais reproductible cohérentes, en particulier HMA et NGS de multiples poissons hétérozygotes, pour créer un simple, économique et protocole expérimentalement robuste pour la mutagénèse induite par le CRISPR chez le poisson zèbre qui est appropriée pour les laboratoires disposant d’employés avec une gamme de formation et expérience, ainsi que des laboratoires d’enseignement.
Recommandations pour la conception et la synthèse du guide que RNAs sont inclus dans le présent protocole. Une considération importante dans le guide de conception de RNA est la minimisation des effets hors cible. Plusieurs algorithmes de prévision ont été développées pour permettre CRISPR-utilisateurs d’accéder aux outils de calcul avec des interfaces graphiques conviviales qui permettent de prédire tant l’activité du guide sur la cible et la possibilité d’effets hors cible34, 35,,36. Un avantage spécifique du système poisson zèbre est taux réduits des effets hors cible car le Cas9 est injecté dans les embryons et par conséquent l’expression est transitoire, qui a été démontré chez la souris, se traduire par une diminution des effets hors cible53. Néanmoins, les effets hors cible ont été démontrées chez le poisson zèbre54. Contrôle des effets hors cible consiste à phénotype fondateur poisson zèbre qui ont été générées par les deux ARN guide indépendant qui ciblent le même gène, comme ces guides seraient très susceptibles d’affecter les sites hors cible différents. Une autre méthode pour réduire au minimum les effets hors cible qui n’est pas décrit dans le présent protocole est l’utilisation d’un Cas9 muté qui génère des cassures monocaténaires sur la cible de l’ADN, qui doivent être réparés avec une grande efficacité. Les pseudos d’ADN situé à proximité d’un de l’autre qui sont complémentaires à l’opposé de l’appariement brins conduit à la formation d’indel efficace au locus désiré et minimise les effets hors cible55,56.
En plus d’avoir des taux différents d’effets hors cible, sgRNAs différentes peuvent avoir des taux différents de mutagenèse de la cible souhaitée57,58,59. Ce protocole utilise HMA pour analyser l’efficacité de la mutagénèse d’une sgRNA donnée à l’aide de hétéroduplex bande formation33,40. Hétéroduplex bandes sont créés par hybridation générées par PCR des brins d’ADN qui contiennent des incompatibilités et peut être facilement résolu par électrophorèse sur gel. Contrairement aux autres méthodes couramment utilisées pour mesurer la formation indel, tels que l’endonucléase T7 dosage ou haute résolution fondre analyse25,26, HMA ne nécessite pas une enzyme cher pour couper l’ADN ne correspondent pas et ne nécessite pas de une analyse complexe de PCR fondre courbes. Ce qui est important, pour vérifier les taux élevés de formation indel dans la population injectée à l’aide de HMA permet également l’enquêteur afin de minimiser le nombre de poissons nécessaires à la production ultérieure de lignes knock out, ce qui réduit le coût d’identification d’une mutation avec le caractéristiques souhaitées.
La facilité relative de production axée sur les CRISPR indels permet la création de multiples allèles de plusieurs gènes à la fois. Logiciel Web est disponible pour l’analyse de simples mutations hétérozygotes poissons à l’aide de Sanger séquençage des produits PCR49. Dans le cas où trois ou plusieurs allèles muté CRISPR sont analysées, NGS pour caractériser la nature de l’indel est probablement plus rentable pour caractériser la nature de l’indel comme cette approche permet une piscine de 50 différents allèles se caractériser à o RCE (voir Table des matières)60,,du6162. Ces économies d’échelle serait particulièrement utile dans un environnement de laboratoire premier cycle.
En résumé, ce protocole fournit des instructions étape par étape de façon reproductible génération haute qualité CRISPR-réactifs (en particulier, sgRNA) telle que moins de poissons adultes doivent être créés et analysées afin d’identifier correctement les allèles mutants d’intérêt, qui réduit également le temps et le coût de production des lignes souhaitées. Ce qui est important, ce protocole a été conçu telle qu’elle peut être appliquée par les laboratoires disposant de ressources limitées pour produire le poisson-zèbre mutant de façon abordable. En outre, nous avons constaté que cette approche convient aux étudiants de premier cycle et étend ainsi les possibilités d’éducation et de formation des étudiants de premier cycle intéressés par une expérience pratique dans l’édition de base CRISPR génome.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R21CA182197 aux J.O.), le W. Ralph et Grace M. Showalter Research Trust et de la Science agronomique de Purdue et l’Extension pour le programme de développement économique (AgSEED). Les données de séquençage Sanger ont été acquises par l’installation de Purdue Genomics Core pris en charge par P30 CA023168. Mary Witucki a été soutenu par la Purdue University Center for Cancer Research Summer Undergraduate Research Program pris en charge par l’Association Cancer du comté de Carroll. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. Nous remercions Benjamin Carter, Ellen Denning et Taylor Sabato pour fournir des commentaires critiques sur le manuscrit. Nous remercions le département de la biochimie à l’appui de ce travail et le centre de recherche de poisson-zèbre à l’Université de Purdue pour leur dévouement dans les soins et le bien-être de notre colonie de poisson-zèbre. Enfin, nous remercions le laboratoire central de Purdue génomique, et contributions de Phillip San Miguel en ce qui concerne les services de la NGS.
CRISPOR | sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/ | ||
Breaking-Cas | sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool | ||
ChopChop | sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ | ||
Primer 3 | PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ | ||
Rnase free technique | http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf | ||
RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. | |
Rnase-free ethanol | Any brand | Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol. | |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP01 | Cas9 protein with nuclear localization signal. |
Target specific oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | Synthesize guide RNAs. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product. | |
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended. | |
EnGen sgRNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E3322 | In vitro transccribe guide RNAs. |
10X TBE | Thermo Fisher | B52 | RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids. |
6X Load Dye | New England BioLabs | B7025S | Loading DNA for electropheresis. |
5M Ammonium acetate | Thermo Fisher | AM9071 | Clean up reagent for purification of guide RNAs. |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any brand | Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free. | |
Nuclease-free Water | Any brand | For synthesis and purification of guide RNAs. | |
RNase away | Thermo Fisher | 10328011 | Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware. |
DNA Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N0467S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
DNA Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N0552S | Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA. |
RNA Ladder | New England BioLabs | N0364S | Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | Casting polyacrylamide gel. |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Casting polyacrylamide gel. |
40% Polyacrylamide (19:1) | BioRad | 161-0154 | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-100G | Casting denaturing polyacrylamide gel. |
RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher | R0641 | Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | Visualization of nucleic acids. |
SYBER Green | Thermo Fisher | S7563 | Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels. |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | RNA clean up, PCR purification. |
MyTaq Polymerase | Bioline | BIO-21105 | For amplification of DNA using PCR. |
Thermocycler | Any brand | PCR amplification. | |
Spectrophotometer | Any brand | NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA. | |
E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate. |
Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection. |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection. |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos. | |
Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
Incubator | Any brand | Maintaining embryos at 28.5 oC. | |
Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long |
Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles. |
Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
30% Polyacylamide (29:1) | BioRad | 161-0156 | Heteroduplex gel casting. |
MS-222 (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A-5040 | Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE |
Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection. | |
1,000 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
NGS Sequencing platform: Wideseq | If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35). | ||
Software for sequence analysis | For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/ | ||
Software for sequence analysis | SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing. |