Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health. Het protocol is goedgekeurd door de Purdue Animal Care en gebruik Comité (PACUC nummer 08-031-11). 1. ontwerp van een sjabloon-specifieke Oligos voor gids RNA productie Selecteer het doel regio van belang zijn voor de codering regio van het gen worden gewijzigd. Dit moet dicht bij het einde 5′ van het gen te genereren een afgeknotte eiwit, maar niet zo dicht zodanig dat een latere in-frame start codon productie van een eiwit met een bescheiden N-terminale afkappen kunt.Opmerking: Een manier om deze mogelijkheid uitsluiten is voor het scannen van de stroomafwaartse codering regio van het gen voor een in frame start codon. Bovendien, kan met behulp van een gids RNA dat zich richt op het midden van een grote exon, helpen om het identificeren van PCR inleidingen voor latere scoring van de resulterende indel. Identificeren van potentiële locaties van de gids in de genomische regio van belang met behulp van een gids RNA selectie program (Zie Tabel van materialen)34,35,,36. Stel in de browser gegevens op Danio rerio en de volgorde van de aangrenzende motief (PAM) protospacer tot 5′-NGG-3 ‘.Opmerking: De ideale gRNA sequenties bevatten een 5 ‘-G in de eerste positie van de gRNA voor efficiënte T7 in vitro transcriptie. Als er geen aanvaardbaar gids is gevonden met een G op de 5 ‘-positie, de basis van de 5 ‘ van een andere gids kan worden gewijzigd op een G of een G op de 5 ‘ einde van de geleider RNA kan worden toegevoegd, maar dit kan snijden efficiëntie37beperken. Maximaliseren van de efficiëntie van het snijden, een optimale gids-reeks heeft 40-80% GC gehalte (hoger is beter), en bevat een G op de 20th positie, grenzend aan de PAM, maar is niet vereist38. Een voorbeeld van een ideale targeting reeks: 5 ‘ – G (N)18 G-3 ‘ – NGG (NGG is de PAM). Naast de bestudering van de resultaten van de gids RNA selectie programma te identificeren van de optimale gids RNAs zoals hierboven beschreven, moet de zorg worden genomen om te voorkomen gids RNAs met voorspelde sterk af-target effecten die sterk downstream analyse bemoeilijken. In het bijzonder begeleiden RNAs met voorspelde af-target effecten vallen onder codering van de regio’s moet worden uitgesloten, waardoor de totale uit-target sites voorspeld moeten worden geminimaliseerd. De output van de gids RNA design tool, de volgorde van de PAM uitsluiten (5 ‘-NGG-3 ‘); het wordt niet gebruikt voor targeting maar omvat de volgorde van de erkenning voor Cas9 decollete. De resterende 20 nucleotiden (nts), toevoegt de T7 promotor volgorde en de volgorde van de overlapping (regio complementair aan een steiger oligo gebruikt voor het synthetiseren van volledige lengte sgRNAs bijgeleverde aanbevolen in vitro transcriptie) in de aangegeven volgorde hieronder om het verkrijgen van een 54 nt oligo: T7 promotor volgorde: 5 ‘-TTCTAATACGACTCACTATA-3 ‘; Begeleiden van RNA volgorde 5 ‘ – G (N)18 G-3 ‘; Overlapping van reeks: 5 ‘-GTTTTAGAGCTAGA-3 ‘ PCR de inleidingen die flank van de voorspelde gesneden site identificeren (Cas9 cleaves 3 nt stroomopwaarts van de PAM-reeks) op een afstand van 50 – 150 basenparen (bp) elk van de snede met behulp van web-gebaseerde software (Zie Tabel van materialen).Opmerking: Deze zal worden gebruikt in een latere stap voor meting van snijden efficiëntie. Als geen geschikt inleidingen worden geïdentificeerd met behulp van deze beperkingen, kan een andere gids RNA site moet worden beschouwd. Bestel 54 nt oligonucleotides voor de productie van de gids RNA en PCR inleidingen voor analyse van de sites van de doelgroep (Zie Tabel van materialen).Opmerking: Als een optionele positieve controle, op mei zitten hulpvaardig voor de productie van een sgRNA gericht op een gen die nodig zijn voor de productie van pigment om te controleren of de prestaties van dit protocol, met behulp van een eenvoudig scoorde visuele fenotype (Zie Figuur 1 voor representatieve resultaten). Een gemeenschappelijke doelstelling is het gen tyrosinase, met behulp van de oligo (gids sequentie van het RNA is onderstreept)39: 5 ‘-TTCTAATACGACTCACTATA-GGACTGGAGGACTTCTGGGG-GTTTTAGAGCTAGA-3 ‘ 2. voorbereiding van de CRISPR-reagentia voor Embryo Microinjection Bestellen van verkrijgbare Cas9 eiwit (zie tabel van materialen).Nota: Injectie van Cas9 mRNA kan ook worden gebruikt voor het genereren van microdeleties in zebrafish40,41, maar zebrafish embryo microinjection met Cas9 eiwit heeft aangetoond dat meer efficiënte32,42. Opschorten van de Cas9 eiwitten in de meegeleverde buffer voor het genereren van een oplossing van 1 mg/mL. Bewaar de oplossing in injectie gebruiksklare porties in PCR buizen bij-80 ° C tot een minimum beperken van het aantal cycli bevriezen-ontdooien. Voor het genereren van een 5 µL injectie oplossing, 2 µL van 1 mg/mL Cas9 oplossing wordt gebruikt, kunnen de Cas9 dus aliquoted in 2 µL aliquots met behulp van PCR strip-buizen. De sgRNA met behulp van de sgRNA in vitro transcriptie synthetiseren kit (Zie Tabel van materialen). Het uitvoeren van de transcriptie in vitro volgens de instructies van de fabrikant.Opmerking: Handhaven RNase-vrije techniek tijdens alle synthese, sanering en injectie voorbereiding stappen oplossing. Bijvoorbeeld, gebruik van wegwerphandschoenen en ze vaak veranderen, buizen en tips die zijn gecertificeerd RNase-vrij, en schone oppervlakken en pipetten met verkrijgbare oplossingen voor decontaminatie labware gebruiken (Zie Tabel van materialen). De kunstmatige sgRNA met behulp van een ammoniumacetaat/neerslag met behulp van RNase-vrije techniek zuiveren.Opmerking: U kunt ook sgRNAs gezuiverd kan worden met behulp van een verscheidenheid van commercieel beschikbare kolom gebaseerde RNA opruimen kits voor een bescheiden prijs. Voeg 25 µL van 5 M ammoniumacetaat en vortex aan meng.Opmerking: Ammonium acetaat oplossing is commercieel beschikbaar (Zie Tabel of Materials), of een oplossing van 5 M kan worden gemaakt in huis door 385.4 mg ammoniumacetaat op moleculaire rang toe te voegen tot 1 mL RNase-gratis water en opgeslagen bij-20 ° C. 150 µL van 200-proof nuclease-vrije ethanol toevoegen aan elk monster. Plaats de reactie in een vriezer-80 ° C voor een minimum van 20 min.Opmerking: De monsters ‘s nachts kunnen worden achtergelaten bij-80 ° C, maar de totale opbrengst van RNA niet aanzienlijk zal toenemen. De monsters op maximale snelheid te centrifugeren (> 16.000 x g) in een microcentrifuge van 4 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant zorgvuldig door langzaam pipetteren uit de vloeistof, ervoor te zorgen dat de RNA-pellet wordt niet verstoord. Voeg 1 mL 70% ethanol (gemaakt door verdunning van de nuclease-vrije ethanol in RNase-gratis water) en meng voorzichtig de buis door het omkeren van het meerdere malen te wassen resterende zout uit de buis. Herhaal de stap van centrifugeren voor 7 min. De bovendrijvende vloeistof verwijderen door het eerste pipetteren uit allermeest naar de oplossing met behulp van een precisiepipet P1000, gebruik dan een P200 pipet om zoveel oplossing verwijderen als mogelijk is zonder storing veroorzaakt de pellet. Droog de RNA-pellet in een schone ruimte, zoals een laminaire flow-kap of een bankje top, voorzichtig om RNase verontreiniging te vermijden, gedurende 15 minuten of tot geen meer vloeistof druppels zijn zichtbaar in de buis. Resuspendeer de pellet in 30 µL van RNase-gratis water, kwantificeren van het product (bijvoorbeeld met een spectrofotometer) en aliquot de oplossing voor langdurige opslag in een vriezer-80 ° C.Opmerking: Typische concentraties variëren van 800-2500 ng/µL. (OPTIONEEL) Controleer of dat full-length RNA is gegenereerd met behulp van ureum/pagina. Ook een agarose gel te gebruiken om te verifiëren dat de RNA intact is.Opmerking: Echter als met behulp van een agarose gel een groter bedrag aan gRNA moet worden uitgevoerd om te visualiseren van RNA, en de lengte niet nauwkeurig kan worden bepaald. Bij het analyseren van de efficiëntie van het doel snijden na injectie van de reagentia in de vis, als er geen of weinig snijden aanwezig moet dan de sgRNA worden gecontroleerd voor afbraak. Gegoten een polyacrylamidegel van 8% in de TBE met 40% polyacrylamide (19:1) en 8 M ureumstikstof met behulp van RNAse-vrije techniek voor de oplossingen en de apparatuur43.Opmerking: Commercieel beschikbare materialen kunnen worden gebruikt voor het reinigen van apparatuur (Zie Tabel van materialen). Nadat de gel is volledig verhard (ongeveer 30 min), de gel equilibreer door deze te plaatsen in de TBE buffer uitvoeren en uitvoeren van elektroforese voor 30 min 5 V/cm. Mix 300 – 500 ng van sgRNA met een gelijk volume 2 x RNA gel laden kleurstof (Zie Tabel van materialen). Met behulp van een P1000, schakelt u de putten van een puin door pipetteren buffer in elke goed meerdere malen uitgevoerd. De oplossing(en) laden en de gel bij 10 V/cm gedurende 2,5 uur lopen.Opmerking: Een marker lane hier is nuttig voor het visualiseren van de lengte van het RNA maar is niet verplicht; over het algemeen is het gemakkelijk herkenbaar als volledige lengte RNA al gesynthetiseerd (Figuur 2). Visualiseer de bands met behulp van een nucleïnezuur vlek (Zie Tabel van materialen).Opmerking: sgRNA banden moeten worden weergegeven als een enkele band, overwegende dat smeren de aantasting van het RNA (Figuur 2 blijkt). 3. microinjection van CRISPR-componenten in Zebrafish embryo ‘s Instellen van het fokken van tanks de nacht vóór het injecteren van door het plaatsen van het aantal gewenste mannetjes en vrouwtjes (meestal 2 vrouwtjes en 1 of 2 mannen) plaats in een tank fokken met een divider in44. Bereid een microinjection plaat met 1,5% agarose in 1 x E3 media (Zie Tabel van materialen) met 0,01% methyleenblauw (een fungicide) door gieten 35 mL van de gesmolten agarose in een 10 cm petrischaal en zachtjes lag een plastic mal maken wig-vormige troggen in de oplossing, te tikken van de mal te elimineren luchtbellen. Toestaan dat de agarose instellen en opslaan van de schotel met een kleine hoeveelheid media en verpakt in paraffine film om te verhinderen dat de plaat uitdrogen bij 4 ° C.Opmerking: Injectie platen zijn herbruikbare wekenlang, totdat de putten vervormd of droog worden, of de plaat begint te schimmel groeien. Op de ochtend van injecteren, ontdooi gezuiverde sgRNA en Cas9 eiwit op ijs. Vergeet niet om alle materialen met handschoenen RNase verontreiniging te voorkomen en te gebruiken RNase-gratis tips en buizen. Genereer een 5 µL injectie oplossing door het combineren van Cas9 eiwit en de sgRNA in een 2:1 ratio van Cas9:sgRNA om de eindconcentraties van 400 pg/nL Cas9 eiwit en 200 pg/nL-sgRNA. Incubeer de Cas9/sgRNA-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om de Cas9 en de sgRNA om te vormen van een complexe ribonucleoprotein. Voeg 0,5 µL van 2.5% wt/vol fenol rood-oplossing (Zie Tabel of Materials), en RNase-gratis water tot een eindvolume van 5 µL.Opmerking: De Ionische sterkte van de oplossing is aangetoond dat invloed hebben op de oplosbaarheid van het complex, dat dus de toevoeging van KCl kan de verhoging van de efficiëntie van de snijden van sgRNAs die lage indel vorming28 vertonenCas9/sgRNA. Maak een injectie naald door te trekken een 1,0 mm glas capillaire met behulp van een trekker van de micropipet. Snijd het puntje van de vers-en-klare naald met behulp van een nieuwe scheermesje of pincet te verkrijgen van een schuine opening die gemakkelijk de chorion en de dooierzak doorboren zal. Plaats de naald in een micromanipulator gekoppeld aan een microinjector met de bron van de lucht ingeschakeld. Pas onder een lichte Microscoop met behulp van de vergroting is geschikt voor de calibratie bepaald voor het specifieke apparaat, de druk van de injectie naar de naald ejects consequent een 1 nL-oplossing in een petrischaal gevuld met minerale olie.Opmerking: De kwaliteit van de naald is van cruciaal belang. Praktijk produceren een naald en het injecteren in de dooierzak van embryo’s, totdat dit vaardigheid is is gemasterd voordat verdere experimenten45. Verwijderen van de scheidingslijn en laat de vis te kweken voor ongeveer 15 min.Opmerking: Langere fokken tijden zal produceren meer embryo’s, maar de injectie moet worden voltooid terwijl de embryo’s stadium de 1-cel de kans maximaliseren dat Cas9 snijden treedt vroeg en derhalve afname genetische mozaïcisme. Embryo’s kunnen worden geïnjecteerd in latere stadia (2 – 4 cel stadia), maar dit kan eventueel de germline overdrachtssnelheid van de gemodificeerde allel afnemen. Verzamelen van de eieren met behulp van een zeef en spoel ze af in een 10 cm 1 x E3 media met 0,0001% methyleenblauw petrischaal. Onderzoeken van de gezondheid van de eieren onder de lichte Microscoop, eventuele onbevruchte eieren en puin te verwijderen. 10 – 15 embryo’s als uninjected-besturingselement in een petrischaal aparte, gelabelde gereserveerd. Zachtjes de eieren op de plaat van de injectie opgewarmd tot kamertemperatuur met behulp van een pipet overdracht, line-up. Onder een Microscoop dissectie bij 2.5 X vergroting, injecteren 1 nL van de oplossing in de dooierzak van elk embryo te injecteren een totaal van 400 pg Cas9 eiwit en 200 pg van sgRNA.Opmerking: Het vergroten van snijden als gewenste of noodzakelijk is, verhogen de uiteindelijke concentratie van Cas9 eiwit aan 800 pg/nL en sgRNA aan 400 pg/nL in de injectie-oplossing; echter, dit kan ook verhogen af-target snijden en/of embryo gezondheid verlagen. Snijden-efficiëntie kan ook worden verhoogd door het injecteren rechtstreeks in de cel-46. Injectie in de dooier zak is echter technisch minder veeleisend en geeft voldoende snijden voor de productie van vis met hoog germline transmissie (> 70% van de nakomelingen met een gewijzigde allel). De geïnjecteerde embryo’s terug te keren naar een goed label petrischaal, bestrijk ze met 1 x E3 media met methyleenblauw, en leg ze in een embryo incubator ingesteld op 28 ° C. Bij 24 h post bevruchting (hpf), inspecteren van de gezondheid van de geïnjecteerde embryo’s, het verwijderen van dode of abnormaal ontwikkelen individuen en wijzigen van de media (Zie Figuur 3). Controleer het tarief van overleven tegen de uninjected controle.Opmerking: Wanneer gericht op een niet-essentiële gen, op minder dan 10% letaliteit verwachting ten opzichte van de uninjected controle. Als verhoogde niveaus van letaliteit worden waargenomen in de gids-geïnjecteerd populaties in vergelijking met de controle van de uninjected, kan het aangeven dat het beoogde gen essentieel voor de ontwikkeling is, of off-target effecten tot mislukte ontwikkeling leiden. De hoeveelheid ingespoten CRISPR-reagentia te verminderen kan het nodig zijn of generatie voor een nieuwe sgRNA met verlaagde off-target effecten kan verplicht worden. De embryo’s terug te keren naar de incubator en blijven groeien de embryo’s tot en met 72 hpf, veranderen de media dagelijks om embryo gezondheid te behouden. 4. analyse van de efficiëntie van Indel formatie met behulp van een HMA Verzamel twee sets van vijf embryo’s uit de ingespoten platen uitgegroeid tot 72 hpf in microcentrifuge buizen en verzamelen een set van vijf embryo’s uit een uninjected controle. Anesthetize van de embryo’s door toevoeging van 0.004% MS-222 (tricaïne) en 2 min wachten. Wilt uitpakken van de gDNA, zachtjes Pipetteer de media uit elke set embryo en 45 µL van 50 mM NaOH toe te voegen. Incubeer de embryo’s bij 95 ° C gedurende 10 min. Verwijder embryo’s uit de warmtebron en koel aan kamertemperatuur. Voeg 5 µL van 1 M Tris-HCl pH = 8, en vortex de monsters krachtig (5 – 10 s). Centrifugeer de oplossing bij max snelheid (> 16.000 x g) in een microcentrifuge van de kamertemperatuur voor 3 min. overbrengen in het supernatant een schone, gelabelde buis en opslaan van de gDNA bij-20 ° C DNA voor maximaal 6 maanden.Opmerking: DNA-fragmenten van ongeveer 900 bp en kleiner zal worden gegenereerd door het gebruik van dit protocol. Een 50 µL PCR reactie met behulp van 2 µL van de voorbereide gDNA van elk monster (met inbegrip van een uninjected controle) instellen per de instructies die bij de polymerase, met behulp van de eerder ontworpen inleidingen flankerend de voorspelde gesneden site geleverd. Zuiveren van de PCR producten met behulp van een PCR opruimen kit (Zie Tabel of Materials), elueer de monsters in 30 µL van water of elutie buffer en kwantificeren van het DNA met een spectrofotometer. Reanneal alle 30 µL van elk gezuiverde PCR-product door het plaatsen van de buizen in een floatable rek in een bad met kokend water (ongeveer 150 mL in een bekerglas van 500 mL). Na 3 min, uitschakelen van de warmtebron en laat de oplossingen afkoelen tot kamertemperatuur, ongeveer 1 uur.Opmerking: Deze stap eerst het DNA gedenatureerd en laat dan de strengen om willekeurig reanneal voor het genereren van mogelijke heteroduplex banden, of niet-overeenkomende dubbel-streng DNA waarin polymorfismen gemaakt door CRISPR-mutagenese en daarom hebben een veranderde elektroforetische mobiliteit ten opzichte van homoduplexes. De laatste cyclus van PCR of helling-down programma in de thermocycler kan ook worden gebruikt om reanneal producten47,48, maar gebruik van de bad met kokend verbeterde resolutie van heteroduplex producten kan opleveren. Voeg 5 µL van 6 x laden kleurstof (Zie Tabel van materialen) aan de reannealed PCR-oplossingen. Gegoten een 15% polyacrylamide/TBE gel met 30% polyacrylamide (29:1). Nadat de gel heeft ingesteld, plaats u het in een elektroforese apparaat met FSME buffer uitgevoerd. Met behulp van een P1000, schakelt u de putten van een puin zoals residuele zouten of gel fragmenten die de putten door zachtjes pipetteren buffer op en neer in de putjes meermaals kunnen belemmeren. Belasting 500 ng van de reannealed PCR producten, en de belasting een besturingselement (voorbeeld van uninjected vis) naast elke set van sgRNA monsters. Stel de gel bij 150 V gedurende 2,5 uur of totdat de kleurstof voorzijde aan de onderkant van de gel is. Visualiseren van de bands met een vlek van nucleic zuur (bijvoorbeeld, ethidiumbromide of SYBR groene (Zie Tabel van materialen)). Het patroon van de band voor elke controle- en CRISPR-geïnjecteerd pool van embryo’s te onderzoeken.Opmerking: De weergave van meerdere bands die trager in de ingespoten versus uninjected rijstroken geeft aan vorming van roman heteroduplex producten (Figuur 4). De aanwezigheid van roman heteroduplex DNA aangeeft dat microdeleties werden gegenereerd door het CRISPR-injectie. Vermindering van de intensiteit van de band homoduplex in de ingespoten oplossingen van ongeveer 50% of meer is in het algemeen voldoende om te resulteren in voldoende germline transmissie. Bovendien extra bands worden soms aangeduid in de uninjected vis, en moeten niet worden beschouwd als heteroduplex bands als waargenomen in de ingespoten vis. Kies de injecties met hoogste snijden efficiëntie ten opzichte van de uninjected controle voor elk doel; embryo’s uit deze injecties kunnen opgroeien vis zoekt microdeleties veroorzaakt vroegtijdige stop codonen worden gebruikt.Opmerking: Voor hoogefficiënte snijden (vermindering van de homoduplex band door ongeveer > 50% intensiteit), screening van 20-30 volwassen vis moet voldoende te verkrijgen germline transmissie.Voor sgRNAs die minder snijden genereren, kunnen meer volwassen vis te verhogen de kans op identificatie van vis die vertonen germline transmissie van gemodificeerde allelen met een voortijdige stop codon nodig zijn. Indien indel vorming niet waargenomen kan het nodig zijn wordt om herontwerp van de sgRNA naar een andere regio van het gen zijn. Indien geen heteroduplex band vorming wordt waargenomen, de sgRNA kan hebben aangetast en de kwaliteit van de sgRNA dient te worden geverifieerd met behulp van een ureum/pagina gel. 5. identificatie en verspreiding van Knock-out lijnen Voer ter identificatie van een potentiële oprichter bovenliggende vis, staart clips van de volwassen F0 vis (uitgegroeid tot ongeveer 2,5-3 maanden) tot het identificeren van de aanwezigheid van microdeleties. Anesthetize van de vis in 0.62 mM tricaïne (Zie Tabel of Materials), dan gebruik een schone, scherpe scheermesje te verwijderen ongeveer 1/2-3/4 van de staartvin. Plaats de staart in 45 µL van 50 mM NaOH en de vis terug te keren naar de tank van een herstel. Het uitvoeren van de winning van gDNA als beschreven (stappen 4.2 – 4.4). Zodra de vis weer normale zwemmen gedrag, plaats de vis terug op stromende systeem water totdat de aard van de indel is vastgesteld.Opmerking: Het is essentieel om ervoor te zorgen dat afzonderlijke vissen geïdentificeerd worden, en op de juiste wijze kunnen worden afgestemd op de resultaten van de staart clips. Zoals beschreven (stappen 4.5-4.9), voeren een HMA op de staart clip gDNA om te bepalen als de vis werd gewijzigd door de CRISPR-injectie (Figuur 5). Fokken om te identificeren een vis van de oprichter, de volwassenen die heteroduplex bands uit staart gDNA wild-type vissen vertonen. Verzamelen van de embryo’s en ze groeien tot en met 72 hpf. Op 72 hpf, verzamelen van 10 embryo’s en plaatst u elk embryo in een individuele buis. Uitvoeren van een extractie van de gDNA zoals hierboven (stappen 4.2 – 4.4) beschreven met behulp van 11.25 µL van 50 mM NaOH en 1,25 µL van 1 M Tris pH = 8. Herhaal de PCR en de elektroforese om te identificeren heteroduplex bands zoals hierboven (stappen 4.7 – 4.13) beschreven om te bepalen als indel allelen doorgevoerd op deze generatie (Figuur 6). Op basis van het percentage transmissie waargenomen in één embryo’s het HMA, groeien gemiddeld 20 tot 30 embryo’s verkregen door het Kruis voor elk CRISPR-lijnen van belang naar volwassenheid.Opmerking: Dit nummer kan worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de frequentie van germline transmissie. Staart clips van de volwassen vis van de F1 te identificeren van de aanwezigheid van microdeleties als beschreven (stappen 5.1-5.2) uit te voeren. Zoals beschreven (stappen 4.5 – 4.11), voeren een HMA op de staart clip gDNA om te bepalen als de vis een indel (Figuur 7 draagt). Voor vis die een heteroduplex band bevatten, voorbereiden op de DNA sequentie-analyse. PCR met behulp van nieuwe inleidingen tot het versterken van een 300-600 bp PCR product gecentreerd rond de gesneden site uitvoeren Gebruik een PCR zuivering kit om opruimen van het DNA, en elueer in 30 µL. onderzoeken het DNA op een agarose gel om ervoor te zorgen dat een enkele band aanwezig is.Opmerking: Sommige heteroduplex “banding” mag aanwezig zijn op de agarose gel en wordt weergegeven als een kleine uitstrijkje of dubbele band net boven het PCR-product op de verwachte grootte. Als één tot drie microdeleties worden geanalyseerd, volgorde van de PCR-producten met behulp van Sanger sequencing en bepalen van de volgorde van de indel met behulp van een hulpprogramma bioinformatics49. Anders, de bepaling van de volgorde van meerdere PCR producten met behulp van NGS analyse (Zie Tabel of Materials) is bovendien voordeliger. Bepalen als een voortijdige stop codon is verkregen door het analyseren van de reeks bioinformatics gereedschap (Zie Tabel van materialen). Plaats de vis met gewenste mutant allel in een nieuwe tank met passende etiketten. PCR inleidingen voor specifieke indel allelen voor toekomstige genotypering behoeften ontwerpen. Deze inleidingen moeten omvatten de gemuteerde volgorde en niet versterken de wild-typen volgorde. In-cross heterozygoot zebrafish voor het genereren van een laagniveau bevolking die 25% knock-out regels zal bevatten.