JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Published: August 28, 2018
doi:
10.3791/56969
, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University

Summary

تحرير الجينوم المستهدفة في النظام النموذجي دانيو rerio (الزرد) إلى حد كبير مما يسر بظهور النهج المستندة إلى كريسبر. هنا، نحن وصف بروتوكول مبسطة وقوية لتوليد وتحديد الآليلات هراء المستمدة من كريسبر يتضمن المقايسة التنقل هيتيرودوبليكس وتحديد الطفرات باستخدام تسلسل الجيل القادم.

Abstract

إينتيرسباسيد توصيف متفاوت المسافات، بانتظام، قصيرة، المتناوب تكرار نظام العقدية المقيّحة (كريسبر) وقد مكن تطوير منصة قابلة للتخصيص لسرعة إنشاء تعديلات الجينات في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الزرد. التحرير على أساس كريسبر الجينوم يستخدم دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) لاستهداف endonuclease المرتبطة كريسبر (Cas) للجينوم الحمض النووي (جدنا) هدفا للفائدة، حيث يولد Cas endonuclease فاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات). إصلاح دسبس بالآليات عرضه للخطأ يؤدي إلى عمليات الإدراج أو الحذف (إينديلس). وهذا يمكن أن يسبب الطفرات فراميشيفت التي كثيرا ما يعرض كودون توقف قبل أوان ضمن تسلسل الترميز، وبالتالي خلق اليل البروتين-فارغة (null). هندسة الجينوم المستندة إلى كريسبر يتطلب سوى عدد قليل من العناصر الجزيئية وهو عرضه بسهولة إلى أجنة الزرد microinjection. هذا البروتوكول وصف الطرق المستخدمة لتوليد الكواشف كريسبر ل microinjection الزرد وتحديد السمك العارضة انتقال germline كريسبر تعديل الجينات. وتشمل هذه الأساليب النسخ في المختبر من سجرناس، microinjection كريسبر الكواشف، تحديد إينديلس التي يسببها في الموقع المستهدف باستخدام أسلوب المستندة إلى PCR يسمى هيتيرودوبليكس التنقل المقايسة (HMA)، ووصف إينديلس استخدام إنتاجية منخفضة وتسلسل الجيل المقبل قوية (خ ع)-على أساس النهج التي يمكن تحليل منتجات PCR متعددة جمعت من الأسماك متخالف. هذا البروتوكول هو تبسيط للتقليل من عدد الأسماك المطلوبة وأنواع المعدات اللازمة لإجراء التحليلات. وعلاوة على ذلك، صمم هذا البروتوكول لتكون قابلة للاستخدام بمختبر الشخصي لجميع مستويات الخبرة بما في ذلك الطلاب الجامعيين، تمكين هذه الأداة القوية اقتصاديا توظيف أي فريق البحوث المهتمة في أداء على أساس كريسبر تعديل الجينوم في الزرد.

Introduction

المحافظة على الآلات الجزيئية عبر حقيقيات النوى يكمن وراء السلطة من استخدام نموذج الكائنات الحية للبحوث. العديد من هذه النظم النموذجية تيسير استخدام النهج عكس الوراثية مثل الجينات المستهدفة بالضربة القاضية لوصف مساهمة منتج الجين إلى عملية بيولوجية أو المرض للفائدة. تقنيات تعطيل الجينات في الكائنات الحية مثل الزرد تاريخيا اعتمد على مقدمة المستهدفة من الطفرات فراميشيفت التي تنجم عن إصلاح دسبس1،2غير دقيقة. عندما يتم إدخال جهاز تسوية المنازعات في الجينوم، يتم إصلاح الآفة الحمض النووي عن طريق أحد مسارين موجودة عالمياً في ما يقرب من جميع أنواع الخلايا والكائنات الحية: نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) وإصلاح موجه التماثل (HDR)3،4 . وكثيراً ما تنتج غير دقيقة طبيعة الآلية نهيج إينديلس من مختلف أطوال5،،من67،،من89. مقدمة طفرات فراميشيفت في تسلسل ترميز الجينات يمكن أن تنتج كودون توقف قبل أوان، الذي كثيرا ما يجعل هذا الجين لا يعمل.

تضمنت استراتيجيات هندسة الجينوم المبكر في الزرد لتعزيز إينديلس ميجانوكليسيس ونوكليسيس إصبع الزنك nucleases المستجيب المنشط مثل النسخ، التي تستخدم تفاعلات البروتين الحمض النووي لاستهداف نوكلاس إلى معين الجينوم الهدف حيث أنها أدخلت هيئة تسوية المنازعات10،11،،من1213،،من1415. ومع ذلك، هذه التكنولوجيات غالباً ما يصعب تطبيقها نظراً للهندسة الشاقة والمعقدة اللازمة لتوليد نوكلاس يستهدف تسلسل الحمض النووي للفائدة. على عكس الاستراتيجيات السابقة، تحرير الجينات على أساس كريسبر لا تعتمد على تفاعلات البروتين-الحمض النووي للاستهداف. بدلاً من ذلك، يتم توجيه endonuclease المرتبطة كريسبر (Cas) عبر دليل الحمض النووي الريبي الذي يستخدم قاعدة الاقتران التفاعلات النوكليوتيدات لاستهداف موقع جينومي لفائدة16،،من1718،19 ،،من2021. سبب البساطة من تصميم الحمض النووي الريبي دليل مع قاعدة المطلوب الاقتران التفاعلات لاستهداف أنه من السهل نسبيا لاستهداف endonuclease Cas إلى المكان المطلوب. نوع نظام كريسبر الثاني لا سيما على نطاق واسع وضعت لتطبيقات تحرير الجينوم بسبب العديد من الميزات مفيدة بما في ذلك استخدام مفردة multidomain Cas نوكلاس (Cas9) التي تتطلب التفاعل مع الحمض النووي لحفز النشاط endonuclease واستخدام الحمض النووي الريبي دليل واحد (سجرنا) لاستهدافها ل تسلسل الحمض النووي المشابهة18. تسلسل المتطلبات اللازمة لاستهداف سجرنا المشابهة هي مفهومة جيدا19، وسجرنا المطلوب يتم إنشاؤها بسهولة بواسطة النسخ في المختبر . بساطة ومتانة النهج كريسبر/Cas9 يسهل إلى حد كبير المستهدفة التحوير الوراثي في الزرد وطائفة واسعة من الكائنات الحية الأخرى.

تعزيز القدرة على القيام بتحرير الجينوم المستهدفة في الزرد نتيجة تطوير الكواشف المستندة إلى كريسبر كثيرا وقد زادت الفرصة لدراسة العمليات رمزاً للكائنات الحية الفقارية مثل تطوير الجهاز العصبي المركزي النظام. ويتضمن الجينوم الزرد أورثولوجس من 70% الجينات ترميز البروتين الموجودة في الجينوم البشري، فضلا عن 84% من المورثات المرتبطة بالأمراض في البشر22. التنمية الزرد معارض عدة من الصفات الرئيسية التي تعزز استخدامها في الدراسات الجينية العكسية: توضع الأجنة في براثن كبيرة، ووضع خارجياً من الأم جعلها قابلة الوراثية تلاعب microinjection، والكبار الزرد ناضجة جنسياً قبل 3 أشهر عمر، مما يسمح للنشر السريع للبنود المطلوب23.

تتوفر العديد من البروتوكولات التي تصف مجموعة متنوعة من النهج لإنشاء وتحديد إينديلس المستمدة من كريسبر في الزرد24،،من2526،،من2728،29 ،،من3031. ومع ذلك، العديد من هذه الإجراءات مرة مكثفة وتحتاج إلى الحصول على معدات غالية الثمن ويمكن أن يكون تحديا لمختبرات مع خبرة محدودة. توفر الخطوات الموضحة هنا بسيطة وقوية واقتصادية كريسبر Cas9-استراتيجية لمهندس الزرد خطوط خروج المغلوب. يصف هذا البروتوكول استخدام مجموعة أدوات ذات كفاءة عالية لتجميع سجرناس باستخدام الحمض النووي النوكليوتيد (أوليجوس)، مماثلة لغيرها من النهج التي تم وصفه سابقا32. بروتوكول وصف يتضمن خطوتين لا سيما أن تبسط إلى حد كبير تحليل خطوط تحور كريسبر: استخدام HMA المستندة إلى بكر33 بسهولة تحديد وجود تعديلات الجينوم، وتحليل تسلسل خطوة بخطوة متخالف الزرد لسرعة وسهولة تحديد طبيعة إينديلس متعددة بطريقة اقتصادية. وبالإضافة إلى ذلك، أدرجت إرشادات خطوة بخطوة للتحديد قوية وموثوق بها الإنتاج والحقن بدليل الكشف. الخطوات المذكورة هنا مثالاً بروتوكول قوية، وغير مكلفة نسبيا التي تمكن العاملين في المختبرات مع مجموعة من الخبرات للمساهمة في تحديد الجينات بالضربة القاضية في الزرد.

Protocol

أجريت هذه الدراسة صارمة وفقا للتوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية “المعاهد الوطنية للصحة”. وأقر البروتوكول بوردو رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (باكوك رقم 31/08/11). 1-تصميم أوليجوس الخاصة بقالب لإنتاج دليل الحمض النووي الريبي قم بتحديد المنطقة المستهدفة من الاهتمام إلى تعديل في منطقة ترميز الجينات. هذا يجب أن تكون قريبة من 5 ‘ نهاية المورثة توليد بروتين مبتوراً، ولكن ليس ذلك إغلاق أن تمكن كودون لاحقة في إطار بدء إنتاج بروتين مع اقتطاع الطرفي ن متواضعة.ملاحظة: طريقة واحدة لاستبعاد هذا الاحتمال لمسح منطقة الترميز المصب من الجينات للبدء إطار في كودون. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام دليل الحمض النووي الريبي الذي يستهدف منتصف إكسون كبيرة، يمكن أن تساعد على تحديد [بكر] كبسولة تفجير للتهديف اللاحقة من إينديل الناتجة. تحديد المواقع دليل المحتملة في منطقة الجينوم في الاهتمام باستخدام دليل الحمض النووي الريبي اختيار البرنامج (انظر الجدول للمواد)34،،من3536. تعيين بيانات المستعرض إلى دانيو rerio وتسلسل بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) إلى 5 ‘-نج-3’.ملاحظة: تسلسل جرنة مثالية تتضمن 5-جي في المركز الأول من جرنة للكفاءة في المختبر T7 النسخ. إذا تم العثور على لا دليل مقبول مع a G في موقف 5 ‘، ويمكن تغيير قاعدة 5’ لدليل آخر على a G أو a G يمكن أن تضاف إلى نهاية 5 ‘ دليل الحمض النووي الريبي، ولكن هذا قد يقلل من كفاءة قطع37. لتعظيم كفاءة القطع، قد تسلسل أمثل دليل محتوى GC 40-80% (أعلى من الأفضل)، ويحتوي على a G في موقفال 20، المتاخمة إلى بام، ولكن ليس المطلوب38. مثال من تسلسل استهداف مثالية: 5-ز (ن)18 ز-3-نج (نج هو بام). وبالإضافة إلى النظر في النتائج من البرنامج التحديد دليل الحمض النووي الريبي لتحديد الدليل الأمثل الكشف كما هو موضح أعلاه، ينبغي الحرص على تجنب دليل الكشف مع توقع آثار قوية خارج الهدف الذي يعقد إلى حد كبير تحليل المتلقين للمعلومات. دليل الكشف على وجه الخصوص، مع توقع الآثار خارج الهدف أن تقع ضمن ترميز المناطق ينبغي أن تستبعد، وينبغي تقليل عدد المواقع خارج الهدف المتوقع. من إخراج أداة تصميم دليل الحمض النووي الريبي، استبعاد التسلسل بام (نج 5 ‘-3’)؛ أنها لا تستخدم لاستهداف ولكن يشمل الاعتراف بالتسلسل للانقسام Cas9. إضافة النيوكليوتيدات 20 المتبقية (nts)، تسلسل المروج T7 وتسلسل التداخل (منطقة مكملة اليغو سقالة المستخدمة لتجميع كامل طول سجرناس المتوفرة في مجموعة أدوات النسخ الموصى بها في المختبر ) بالترتيب المشار إليه أدناه للحصول اليغو nt 54: T7 المروج التسلسل: 5-تكتاتاكجاكتكاكتاتا-3 ‘؛ دليل الحمض النووي الريبي تسلسل 5-ز (ن)18 ز-3 ‘؛ تتداخل التسلسل: 5-جتتتاجاجكتاجا-3 تحديد الإشعال بكر أن الجناح الموقع قطع المتوقعة (كليفس Cas9 3 nt المنبع في التسلسل بام) على مسافة من 50 – 150 زوج قاعدي (bp) كل من خفض استخدام البرامج المستندة إلى الويب (انظر الجدول للمواد).ملاحظة: هذه ستستخدم في خطوة لاحقة لقياس كفاءة القطع. إذا تم تحديد لا أجهزة الإشعال المناسبة استخدام هذه القيود، موقع الجيش الملكي النيبالي دليل آخر قد يلزم النظر فيها. تأمر 54 النوكليوتيد nt لإنتاج الدليل كبسولة تفجير الجيش الملكي النيبالي وبكر لتحليل المواقع المستهدفة (انظر الجدول للمواد).ملاحظة: كعنصر إيجابي اختياري، قد يكون من المفيد لإنتاج سجرنا استهداف جينات اللازمة لإنتاج الصباغ التحقق من أداء هذا البروتوكول النمط الظاهري بصرية سجل بسهولة باستخدام (انظر الشكل 1 للنتائج التمثيلية). هدف مشترك هو الجينات التيروزينات، اليغو باستخدام دليل تسلسل الحمض النووي الريبي (المسطر)39: 5-تكتاتاكجاكتكاكتاتاجاكتجاجاكتكتججججتتتاجاجكتاجا-3 2-إعداد الكواشف كريسبر Microinjection الجنين أمر متاح تجارياً Cas9 البروتين (انظر الجدول للمواد).ملاحظة: حقن Cas9 مرناً أيضا استخدامها لتوليد إينديلس في الزرد40،41، لكن قد تبين الزرد الجنين microinjection مع البروتين Cas9 يكون أكثر كفاءة32،42. تعليق البروتين Cas9 في المخزن المؤقت الذي تم توفيره لإنشاء حل 1 ملغ/مل. تخزين الحل في مختبرين جاهزة للحقن في أنابيب PCR في-80 درجة مئوية لتقليل عدد دورات تجميد أذاب. لإنشاء حل حقن 5 ميليلتر، ميليلتر 2 1 ملغ/مل Cas9 يستخدم الحل، ولذلك يمكن Cas9 الكوتيد في 2 ميليلتر مختبرين استخدام PCR قطاع-أنابيب. توليف سجرنا سجرنا النسخ في المختبر باستخدام كيت (انظر الجدول للمواد). إجراء النسخ في المختبر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.ملاحظة: الحفاظ على تقنية خالية من رناسي خلال خطوات إعداد التوليف وتنظيف، وحقن حل جميع. على سبيل المثال، استخدام القفازات المتاح وتغيير لهم في كثير من الأحيان، واستخدام أنابيب والنصائح التي هي معتمدة خالية من رناسي، وتنظيف السطوح والماصات مع الحلول المتاحة تجارياً تطهير المختبرات الطبية (انظر الجدول للمواد). تنقية سجرنا المركب تستخدم ترسيب خلات أمونيوم/استخدام تقنية رناسي خالية.ملاحظة: بدلاً من ذلك، سجرناس يمكن أن تكون تنقيتها باستخدام مجموعة متنوعة من المتاحة تجارياً من الجيش الملكي النيبالي على أساس العمود تنظيف مجموعات بتكلفة متواضعة نسبيا. إضافة 25 ميليلتر من خلات الأمونيوم 5 م ودوامه مزيج دقيق.ملاحظة: الحل خلات الأمونيوم متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد)، أو يمكن إجراؤها في المنزل بإضافة 385.4 مغ خلات الأمونيوم الصف الجزيئية إلى 1 مل مياه خالية من رناسي حل م 5 والمخزنة في-20 درجة مئوية. إضافة 150 ميليلتر من الإيثانول خالية نوكلاس واقية من 200 لكل عينة. ضع رد فعل في ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.ملاحظة: العينات التي يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية، ولكن لن تزيد إلى حد كبير إجمالي العائد الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي العينات بأقصى سرعة ممكنة (> س 16,000 ز) في ميكروسينتريفوجي 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة المادة طافية بعناية عن طريق بيبيتينج ببطء قبالة السائل، ضمان عدم تعكير بيليه الجيش الملكي النيبالي. أضف 1 مل إيثانول 70 ٪ (الذي أنشأته تمييع الإيثانول نوكلاس خالية في المياه خالية من رناسي) وخلط الأنبوب بلطف بعكس ذلك عدة مرات لغسل الملح المتبقي من الأنبوب. كرر الخطوة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق. إزالة المادة طافية بأول بيبيتينج قبالة معظم الحل باستخدام ماصة P1000، ثم استخدم ماصة P200 لإزالة الحل قدر الإمكان دون مقاومة بيليه. جاف بيليه الجيش الملكي النيبالي في مساحة نظيفة، مثل غطاء الاندفاق الصفحي أو أعلى مقاعد البدلاء، مع الحرص على تجنب تلوث رناسي, لمدة 15 دقيقة أو حتى لا سائل أكثر قطرات مرئية في الأنبوب. ريسوسبيند بيليه في 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي، وتحديد حجم المنتج (على سبيل المثال باستخدام جهاز المطياف الضوئي)، وقاسمه الحل للتخزين على المدى الطويل في ثلاجة-80 درجة مئوية.ملاحظة: تتراوح تركيزات نموذجية من 800-2,500 نانوغرام/ميليلتر. (اختياري) تحقق من أن طول الحمض النووي الريبي تم إنشاؤها باستخدام اليوريا/صفحة. بدلاً من ذلك، استخدم [اغروس] هلام للتحقق من أن الجيش الملكي النيبالي سليمة.ملاحظة: ومع ذلك، في حالة استخدام [اغروس] هلام يجب تشغيل قدرا أكبر من جرنا تصور الجيش الملكي النيبالي، والطول لا يمكن تحديده بدقة. عند تحليل كفاءة الهدف قطع بعد حقن المواد الكاشفة في الأسماك، وإذا كان هناك قطع القليل أو لا هذا ثم سجرنا يجب التحقق من التدهور. يلقي جل polyacrylamide 8% في TBE مع 40% polyacrylamide (19:1) واليوريا م 8 باستخدام تقنية خالية من رناسي للحلول والمعدات43.ملاحظة: يمكن استخدام المواد المتاحة تجارياً لتنظيف المعدات (انظر الجدول للمواد). بعد وقد وطدت الجل تماما (حوالي 30 دقيقة)، حجته الهلام بوضعه في TBE تشغيل المخزن المؤقت وإجراء التفريد لمدة 30 دقيقة في الخامس 5/سم. مزيج صبغ 300 – 500 نانوغرام من سجرنا مع حجم تساوي 2 × تحميل جل الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد). استخدام P1000، مسح الآبار أي الحطام قبل بيبيتينج تشغيل المخزن المؤقت في كل جيدا عدة مرات. تحميل اﻷض وتشغيل الهلام في الخامس 10/سم بالنسبة ح 2.5.ملاحظة: ممر علامة هنا مفيد لتصور طول الجيش الملكي النيبالي لكن ليس مطلوباً؛ عموما أنها بادية للعيان إذا كامل طول الحمض النووي الريبي قد تم تصنيعه (الشكل 2). وضع تصور للعصابات باستخدام حمض النووي وصمة عار (انظر الجدول للمواد).ملاحظة: يجب أن تظهر عصابات سجرنا عصابة واحدة، بينما تلطخ تشير إلى تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 2). 3-microinjection كريسبر–المكونات في الأجنة الزرد إعداد تربية الدبابات الليلة قبل الحقن بوضع العدد المطلوب من الذكور والإناث (عادة 2 من الإناث والذكور 1 أو 2) في التفريخ مع مقسم في مكان44. إعداد لوحة microinjection مع [اغروس] 1.5% في الإعلام x E3 1 (انظر الجدول للمواد) مع 0.01 ٪ الميثيلين الأزرق (مبيد لفطريات) بصب 35 مل من ذاب [اغروس] إلى 10 سم طبق بيتري ولطف يكمن العفن بلاستيك لإنشاء أحواض على شكل آسفين إلى حل، والتنصت على العفن للقضاء على فقاعات الهواء. يسمح [اغروس] تعيين، وتخزين الطبق مع كمية صغيرة من وسائل الإعلام وملفوفة في الفيلم البرافين لمنع اللوحة من جفاف في 4 درجات مئوية.ملاحظة: لوحات الحقن قابلة لإعادة الاستخدام لعدة أسابيع، حتى أصبحت الآبار مشوه أو الجافة، أو اللوحة يبدأ ينمو العفن. في صباح يوم من الحقن، ذوبان الجليد سجرنا المنقي والبروتين Cas9 على الجليد. تذكر أن التعامل مع جميع المواد مع قفازات لمنع تلوث رناسي واستخدام نصائح مجانية رناسي وأنابيب. إنشاء حل حقن 5 ميليلتر من خلال الجمع بين البروتين Cas9 وسجرنا بنسبة 2:1 من Cas9:sgRNA للحصول على تركيزات نهائية من 400 بيكوغرام/nL Cas9 البروتين و 200 جزء من الغرام/nL سجرنا. احتضان الحل Cas9/سجرنا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح ب Cas9 وسجرنا لتشكيل ريبونوكليوبروتين معقدة. إضافة 0.5 ميليلتر من محلول الفينول الأحمر wt/المجلد 2.5% (انظر الجدول للمواد)، وخالية من رناسي المياه إلى وحدة تخزين نهائي من 5 ميليلتر.ملاحظة: قد تبين قوة الحل الأيونية تؤثر على قابلية الذوبان من معقدة، ولذلك يجوز إضافة بوكل زيادة كفاءة قطع سجرناس الذي يحمل إينديل منخفضة تشكيل28Cas9/سجرنا. جعل إبرة حقن عن طريق سحب زجاج 1.0 مم الشعرية استخدام ساحبة ميكروبيبيتي. قص غيض إبرة الطازجة استخدام شفرة حلاقة جديدة أو الملقط للحصول على انفتاح زاوية التي سيتم بسهولة اختراق المشيمة وكيس ألمح. ضع الإبرة في ميكرومانيبولاتور تعلق على ميكروينجيكتور مع الهواء المصدر قيد التشغيل. تحت مجهر خفيفة استخدام التكبير مناسبة لمعايرة مصممة لجهاز معين، ضبط ضغط الحقن حتى إخراج الإبرة الدوام حلاً nL 1 إلى طبق بتري مليئة بالزيوت المعدنية.ملاحظة: نوعية الإبرة أمر بالغ الأهمية. هو يتقن الممارسة تنتج إبرة وحقن في كيس ألمح أجنة حتى هذا مهارة قبل محاولة مواصلة التجارب45. إزالة الفاصل والسماح للأسماك إلى تولد لمدة 15 دقيقة تقريبا.ملاحظة: سوف تنتج أوقات أطول في تربية الأجنة أكثر، ينبغي أن تكتمل إلا الحقن بينما الأجنة في المرحلة 1-الخلية إلى أقصى حد الفرصة أن قطع Cas9 سوف تحدث مبكرا وبالتالي انخفاض mosaicism الوراثية. يمكن حقن الأجنة في مراحل لاحقة (2 – 4 مراحل الخلية)، ولكن هذا قد ربما ينخفض معدل انتقال germline اليل معدلة. جمع البيض باستخدام مصفاة وشطف لهم إلى 10 سم طبق بيتري استخدام وسائط الإعلام x E3 1 مع أزرق الميثيلين 0.0001%. فحص صحة البيض تحت المجهر الخفيفة، إزالة أي البيض المخصبة والحطام. جانبا الأجنة 10 – 15 كعنصر تحكم أونينجيكتيد في طبق بتري منفصلة، والمسمى. استخدام ماصة نقل، الخط برفق البيض على لوحة حقن تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة. تحت مجهر تشريح في 2.5 X التكبير، حقن 1 nL الحل في كيس ألمح كل جنين ضخ ما مجموعة 400 بيكوغرام من البروتين Cas9 والغرام 200 من سجرنا.ملاحظة: لزيادة القطع إذا كان المطلوب أو ضروريا، زيادة التركيز النهائي للبروتين Cas9 إلى 800 بيكوغرام/nL وسجرنا إلى 400 جزء من الغرام/nL في الحل الحقن؛ ومع ذلك، هذا قد أيضا زيادة قطع خارج الهدف أو إنقاص صحة الجنين. كما يمكن زيادة كفاءة القطع بالحقن مباشرة في الخلية46. ومع ذلك، ضخ في كيس الصفار تقنيا أقل تطلبا ويعطي قطع كافية لإنتاج الأسماك مع انتقال germline عالية (> 70% ذرية تحتوي على اليل معدلة). إعادة حقن الأجنة إلى طبق بتري مسماة بشكل صحيح وغطاء لهم مع وسائل الإعلام x E3 1 مع أزرق الميثيلين، ووضعها في حاضنة جنين تعيين إلى 28 درجة مئوية. في 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) وفحص صحة الأجنة المحقون، إزالة الأفراد النامية ميتا أو عادي وتغيير وسائط الإعلام (انظر الشكل 3). تحقق من أن معدل البقاء على قيد الحياة ضد عنصر التحكم أونينجيكتيد.ملاحظة: عند استهداف الجين غير الضروريين، أقل من 10% الفتك المتوقع بالنسبة لعنصر التحكم أونينجيكتيد. إذا لوحظت مستويات مرتفعة من الفتك في السكان حقن دليل مقارنة لعنصر التحكم أونينجيكتيد، فقد يدل على أن الجينات المستهدفة أمر ضروري للتنمية، أو آثار خارج الهدف وتؤدي إلى فشل التنمية. تقليل كمية حقن كريسبر-الكواشف قد تكون ضرورية أو توليد سجرنا جديدة مع انخفاض خارج الهدف آثار قد تكون مطلوبة. إرجاع الأجنة للحاضنة ومواصلة نمو الأجنة إلى 72 هبف، تغيير وسائل الإعلام يوميا للحفاظ على صحة الجنين. 4-تحليل للكفاءة لتشكيل إينديل باستخدام HMA جمع مجموعتين من خمسة أجنة من لوحات حقن ارتفع إلى 72 هبف في أنابيب ميكروسينتريفوجي، وجمع مجموعة من خمسة أجنة من عنصر تحكم أونينجيكتيد. تخدير الأجنة عن طريق إضافة 0.004% مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (تريكيني) وانتظر 2 دقيقة. لاستخراج في جدنا، بلطف “الماصة؛” وسائل الإعلام إيقاف كل مجموعة الأجنة وإضافة ميليلتر 45 من 50 مم هيدروكسيد الصوديوم. تبني الأجنة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة الأجنة من مصدر الحرارة وبارد بدرجة حرارة الغرفة. إضافة 5 ميليلتر من 1 م تريس-HCl pH = 8، ودوامه العينات بقوة (ق 5 – 10). الطرد المركزي الحل في أقصى سرعة (> ز س 16,000) في ميكروسينتريفوجي درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 3 نقل المادة طافية إلى أنبوب نظيفة، المسمى وتخزين جدنا في-20 درجة مئوية الحمض النووي لمدة تصل إلى 6 أشهر.ملاحظة: شظايا من الحمض النووي من حوالي 900 شركة بريتيش بتروليوم وسوف أصغر يتم إنشاؤها من خلال استخدام هذا البروتوكول. إعداد 50 ميليلتر بكر رد فعل استخدام 2 ميليلتر من جدنا استعداد من كل عينة (بما في ذلك عنصر تحكم أونينجيكتيد) حسب التعليمات المرفقة مع بوليميريز، استخدام كبسولة تفجير المصممة مسبقاً المرافقة الموقع قطع المتوقعة. تنقية بكر المنتجات باستخدام PCR تنظيف كيت (انظر الجدول للمواد)، الوتي العينات في 30 ميليلتر من المخزن المؤقت ماء أو شطف وكمياً الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. رانيل كل ميليلتر 30 لكل منتج بكر المنقي بوضع الأنابيب في رف عائمة في حمام الماء مغلي (حوالي 150 مل في كوب 500 مل). وبعد 3 دقائق، إيقاف مصدر الحرارة وتسمح الحلول لتبرد بدرجة حرارة الغرفة، حوالي 1 ح.ملاحظة: هذه الخطوة الأولى ديناتوريس في الحمض النووي ويسمح ثم الخيوط رانيل عشوائياً لتوليد عصابات هيتيرودوبليكس ممكن، أو غير متطابقة الحمض النووي المزدوج-حبلا يحتوي على مجمع الأشكال المتعددة تم إنشاؤها بواسطة كريسبر-الطفرات وذلك يكون تغيير التنقل الغرواني الكهربي مقارنة هومودوبليكسيس. دورة الماضي PCR أو منحدر إلى أسفل البرنامج في ثيرموسيكلير يمكن أن تستخدم أيضا رانيل منتجات47،48، ولكن استخدام الحمام المغلي قد تسفر عن قرار تحسين المنتجات هيتيرودوبليكس. إضافة 5 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ (انظر الجدول للمواد) للحلول PCR رينالد. يلقي هلام polyacrylamide/TBE 15% استخدام 30% polyacrylamide (فيها). بعد أن حددت الهلام، وضعه في جهاز التفريد مع TBE تشغيل المخزن المؤقت. استخدام P1000، مسح آبار أي حطام مثل الأملاح المتبقية أو هلام الأجزاء التي يمكن أن تعرقل الآبار بلطف بيبيتينج المخزن المؤقت صعودا وهبوطاً في الآبار عدة مرات. تحميل 500 نانوغرام من منتجات PCR ريانياليد، وتحميل عنصر تحكم (عينة من الأسماك أونينجيكتيد) بجوار كل مجموعة من عينات سجرنا. تشغيل الجل 150 الخامس لح 2.5 أو حتى صبغ والجبهة في الجزء السفلي من الجل. وضع تصور للعصابات باستخدام حمض النووي وصمة عار (مثلاً، اثيديوم بروميد أو سيبر الأخضر (انظر الجدول للمواد)). دراسة نمط الفرقة لكل عنصر تحكم وتجمع كريسبر حقن الأجنة.ملاحظة: ظهور متعددة العصابات التي يعمل بشكل أبطأ في حقن مقابل الممرات أونينجيكتيد يشير إلى تشكيل هيتيرودوبليكس رواية المنتجات (الشكل 4). وجود رواية هيتيرودوبليكس الحمض النووي يشير إلى أن إينديلس تم إنشاؤها بواسطة كريسبر-الحقن. انخفاض في كثافة الفرقة هومودوبليكس في الحلول التي ضخت حوالي 50% أو أكثر يكفي بوجه عام أن يؤدي انتقال germline كافية. بالإضافة إلى ذلك، نطاقات إضافية محددة في بعض الأحيان في السمك أونينجيكتيد، ولا ينبغي أن تعتبر عصابات هيتيرودوبليكس عندما لاحظ في الأسماك حقن. اختر الحقن مع الكفاءة الشاملة لقطاعات أعلى بالنسبة لعنصر التحكم أونينجيكتيد لكل هدف؛ يمكن استخدام الأجنة من هذه الحقن لتنمو الأسماك للبحث عن إينديلس مما تسبب في توقف سابق لأوانه codons.ملاحظة: لقطع (تخفيض في الفرقة هومودوبليكس بحوالي > 50% كثافتها)، ذات كفاءة عالية وفحص الأسماك البالغين 20-30 ينبغي أن تكون كافية للحصول على انتقال الخط.سجرناس التي تولد أقل قطع، قد يلزم السمك أكثر من الكبار لزيادة احتمال تحديد السمك الذي يحمل germline من الآليلات المعدلة تتضمن كودون توقف قبل أوان انتقال. إذا لم يلاحظ تشكيل إينديل قد يكون من الضروري إعادة تصميم سجرنا إلى منطقة مختلفة من الجين. إذا لوحظ لا تشكيل عصابة هيتيرودوبليكس، ربما قد تدهورت سجرنا، ونوعية سجرنا ينبغي التحقق من استخدام هلام يوريا/صفحة. 5-تحديد ونشر خطوط المغلوب تحديد سمكة أصل مؤسس محتملة، أداء مقاطع ذيل سمكة F0 الكبار (نمت إلى حوالي 2.5-3 أشهر) التعرف على وجود إينديلس. تخدير الأسماك في تريكيني 0.62 مم (انظر الجدول للمواد)، ثم استخدم شفرة حلاقة نظيفة وحادة لإزالة حوالي 1/2-3/4 زعنفة الذيل. وضع الذيل في ميليلتر 45 من 50 مم هيدروكسيد الصوديوم، وتعود الأسماك إلى خزان لانتعاش. القيام باستخراج جدنا كوصف (الخطوات 4، 4، 2-4). حالما يستأنف الأسماك السلوك الطبيعي السباحة، ضع الأسماك مرة أخرى على تدفق المياه النظام حتى يتم التعرف على طبيعة إينديل.ملاحظة: من المهم للتأكد من أن الأسماك الفردية قابلة للتحديد، ويمكن أن تكون مطابقة على نحو مناسب لنتائج القصاصات الذيل. كما هو موضح (خطوات 4.5-4.9)، أداء HMA على جدنا مقطع الذيل تحديد إذا كان قد تم تعديل الأسماك عن طريق الحقن كريسبر (الشكل 5). تحديد سمكة مؤسس، تولد الكبار التي يحمل العصابات هيتيرودوبليكس من جدنا الذيل للأسماك البرية من نوع. جمع الأجنة وزراعتها إلى 72 هبف. في 72 هبف، جمع 10 الأجنة ووضع كل الجنين في أنبوب فردية. القيام باستخراج جدنا كما هو موضح أعلاه (خطوات 4.2 – 4.4) استخدام 11.25 ميليلتر من 50 مم هيدروكسيد الصوديوم و 1.25 ميليلتر من الأس الهيدروجيني تريس م 1 = 8. كرر بكر والتفريد لتحديد نطاقات هيتيرودوبليكس كما هو موضح أعلاه (خطوات 4.7 – 4.13) لتحديد إذا تم تمريرها الآليلات إينديل لهذا الجيل (الشكل 6). استناداً إلى نسبة انتقال لوحظت في الأجنة واحد استخدام HMA، ينمو في متوسط 20 – 30 الأجنة التي حصل عليها الصليب لكل خطوط كريسبر الاهتمام إلى مرحلة البلوغ.ملاحظة: قد زاد هذا العدد أو ينقص تبعاً لتواتر نقل الخط. أداء مقاطع ذيل سمكة F1 الكبار التعرف على وجود إينديلس كوصف (الخطوات 5، 1-5، 2). كما هو موضح (خطوات 4.5 – 4.11)، أداء HMA على جدنا مقطع الذيل لتحديد إذا كانت الأسماك يحمل إينديل (الشكل 7). للأسماك التي تحتوي على عصابة هيتيرودوبليكس، إعداد الحمض النووي لتحليل التسلسل. إجراء PCR باستخدام كبسولة تفجير جديدة لتضخيم 300-600 منتج PCR bp تتمحور حول الموقع قطع. استخدام مجموعة أدوات تنقية PCR لتنظيف الحمض النووي، والوتي في 30 ميليلتر. فحص الحمض النووي على [اغروس] هلام تتأكد من عصابة واحدة.ملاحظة: بعض النطاقات هيتيرودوبليكس قد تكون موجودة على [اغروس] هلام ويظهر المسحات الصغيرة أو الفرقة مزدوجة فقط فوق المنتج بكر في الحجم المتوقع. إذا كان يتم تحليل واحد إلى ثلاثة إينديلس، منتجات PCR سانجر باستخدام تسلسل ترتيب وتحديد تسلسل إينديل استخدام أداة المعلوماتية الحيوية49. وإلا، تحديد تسلسل منتجات PCR متعددة باستخدام تحليل خ ع (انظر الجدول للمواد) أكثر اقتصادا. تحديد إذا تم الحصول على كودون توقف قبل أوان خلال تحليل التسلسل باستخدام أداة المعلوماتية الحيوية (انظر الجدول للمواد). ضع السمك يحتوي على المطلوب اليل متحولة إلى دبابة جديدة مع التسميات المناسبة. تصميم [بكر] كبسولة تفجير الآليلات إينديل محددة للاحتياجات المستقبلية التنميط. هذه ينبغي أن تمتد عبر تسلسل تحور وعدم تضخيم تسلسل البرية من نوع. في الصليب الزرد متخالف لتوليد فصل سكان التي سوف تحتوي على خطوط المغلوب 25%.

Representative Results

تسمح النهج التجريبية المبينة في هذا البروتوكول للإنتاج تتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة لخطوط المغلوب الزرد باستخدام تكنولوجيا كريسبر/Cas9. الأرقام التالية قد أدرجت في هذه الوثيقة لتيسير التفسير، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. وعقب النجاح في إنتاج و microinjection كريسبر-الكواشف، يمكن تحليلها الأجنة الزرد لتعمل العلنية وتشكيل إينديل استخدام HMA. هو عنصر تحكم مفيدة لتصور نجاح كريسبر-التجربة استخدام سجرنا هو موضح في الخطوة 1، 5 لاستهداف الجينات المنتجة للصباغ التيروزينات. تشكيل إينديل الناجمة عن Cas9 في التيروزينات يؤدي إلى فقدان تصبغ ويتم بسهولة وسجل 48 هبف (الشكل 1). عنصر تحكم آخر مفيدة لضمان إعداد كريسبر-الكواشف للحقن قد نجحت، للتحقق من أن طول (120 nt) سجرنا تم تصنيعه باستخدام هلام polyacrylamide يشوه (الشكل 2، لين 1 و 2). إذا تدهورت الجيش الملكي النيبالي قد يظهر كتشويه، على سبيل المثال يبين لين 3 (الشكل 2) الجيش الملكي النيبالي المتدهورة التي لا تصلح للحقن. لتحليل تواتر الجينات المستهدفة كريسبر-Cas9 التي لا ينتج عنها علنية تعمل مثل التيروزينات، تشكيل إينديل التحليل HMA طريقة بسيطة وموثوق بها. سجرنا/Cas9 حقن الأجنة تحليل استخدام HMA النتائج في تشكيل عصابات هيتيرودوبليكس، والحد من كثافة الفرقة هومودوبليكس (الشكل 4). وجود عصابات هيتيرودوبليكس ويستخدم كذلك في هذا البروتوكول تحديد الأسماك مؤسس المحتملة من الأجنة ميكروينجيكتيد والكبار (الشكل 4 و الشكل 5)، تحليل كفاءة انتقال germline مؤسس ( 6 الرقم)، والتحقق من وجود إينديل في سمكة F1 متخالف (الشكل 7). الأسماك متخالف يحتوي إينديل مرشحة خ ع لتحديد طبيعة إينديل وتحديد ما إذا كان كودون توقف قبل أوان موجودة في منطقة ترميز الجينات المستهدفة. الشكل 1 : يحمل أجنة الزرد عيب صباغ عند حقن سجرنا استهداف التيروزينات في مرحلة واحدة-خلية- (أ) البرية من نوع، أونينجيكتيد الجنين في 48 هبف) و (ب) حقن الأجنة في 48 هبف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : النسخ في المختبر من سجرنا استخدام طقم التوليف. تم توليفها أوليجوس استخدام النسخ في المختبر وفقا لتعليمات كيت سجرنا التوليف. 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي تم تشغيلها على جل يوريا/صفحة كما هو موضح. سجرنا محملة في حارات 1 و 2 إظهار شريط المقابلة على طول كامل، 120 سليمة nt الجيش الملكي النيبالي. ويبين سجرنا في حارة 3 عينة الحمض النووي الريبي متدهورة التي لا تصلح للحقن. الشكل 3 : مقارنة بين صحة 24 هبف حقن الأجنة. وضعت جنينا معيشة (A) إلى 24 هبف، يتميز بسهولة من جنين تم إحباطها بالتنمية (ب). الأجنة التي تشبه (ب) أو بصورة جذرية غيرت ملامح إلى (أ)، مثل انحناء العمود الفقري أو تغيير رئيس ويجب إزالة العين التنمية من الطبق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : هيتيرودوبليكس التنقل المقايسة من سجرنا-Cas9 ميكروينجيكتيد الأجنة الزرد. برك أجنة 5 كل عينة جمعت في 72 تم استخراج هبف وجدنا. تم إجراء تحليل هيتيرودوبليكس كما هو موضح، عينات تم تحميلها على قدم المساواة مع 500 نانوغرام من الحمض النووي. الممرات: M = 100 شركة بريتيش بتروليوم علامة؛ 1 = التحكم أونينجيكتيد؛ 2 = حقن عينة 1؛ 3 = حقن عينة 2. توقع حجم الفرقة = 98 bp. الشكل 5 : هيتيرودوبليكس التنقل المقايسة لجدنا المستخرجة من ذيل الكبار الزرد حقن كريسبر. كانت تزرع الأجنة التي تم ضخها مع سجرنا والبروتين Cas9 إلى سن البلوغ (3 أشهر). الأسماك ب وج يحمل عصابات هيتيرودوبليكس وكانت ولدت في وقت لاحق لتحديد الفعل أحال إينديلس؛ ولم يستخدم الأسماك A في التحليل اللاحق نظراً لأنه لا يحمل عصابة هيتيرودوبليكس إيجابية. الممرات: 1 = البرية من نوع التحكم؛ 2 = السمك ألف؛ 3 = السمك ب؛ 4 = “السمك جيم يتوقع” حجم الفرقة = 98 هناك الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 6 : هيتيرودوبليكس التنقل المقايسة وحيدة الأجنة الناتجة عن تربية الزرد حقن كريسبر F0 لأسماك البرية من نوع لتحديد إينديلس germline أحال. تم تزاوج الزرد، وتم جمع الأجنة F1 تزرع للأجنة واحد حاء – 72 وإجراء تحليل هيتيرودوبليكس كما هو موضح. الممرات: 1 = البرية من نوع التحكم؛ 2-10 = جنينا F1 واحد كل حارة. ويبين هذا جل أن 7 من أصل 10 أجنة إظهار عصابة هيتيرودوبليكس إيجابية، مما يشير إلى معدل 70% إينديل انتقال الخط. توقع حجم الفرقة = 98 هناك الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 7 : هيتيرودوبليكس التنقل المقايسة للكبار F1 الزرد ذيل مقاطع. وقد سجل الكبار F1 الأسماك HMA تحديد إينديلس. كانت الأسماك التي عرضت عصابة هيتيرودوبليكس إيجابية PCR تضخيمه ومقدمة لتحليل تسلسل واسعة لتحديد طبيعة الطفرة. (أ) الممرات: 1 = البرية من نوع التحكم؛ 2 = السمك (4 bp حذف، عدم تطابق بي بي 1). (ب) F1 هذه الأسماك حددت من المؤسس نفسه، وتظهر هيتيرودوبليكس مختلفة الزخرفة، مما يشير إلى انتقال germline متعددة الآليلات معدلة من مؤسسة واحدة. الممرات: 1 = البرية من نوع التحكم؛ 2 = السمك ب (4 bp الإدراج، 7 عدم تطابق bp)، 3 = السمك (4 bp الحذف، 4 عدم تطابق bp). إنشاء كل من هذه إينديلس كودون توقف قبل أوان في الترميز تسلسل الجين المستهدف، كما يحددها خ ع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذا البروتوكول إنتاج الجينات بالضربة القاضية في النظام النموذجي الفقاريات الزرد باستخدام تكنولوجيا كريسبر-Cas9. وقد وصف عدد من البروتوكولات سابقا إجراء هندسة الجينوم كريسبر بوساطة في الزرد15،،من2526،50،،من5152. هذا البروتوكول يعتمد على الجهود السابقة من خلال الجمع بين عدد من التقنيات التجريبية بسيطة بعد تكاثر متسقة، وبخاصة HMA وخ ع من الأسماك متخالف، إنشاء مباشرة، اقتصادا، وبروتوكول تجريبيا قوية متعددة لوساطة كريسبر الطفرات في الزرد المناسب لمختبرات مزودة بالموظفين مع طائفة من التدريب والخبرة، فضلا عن تدريس مختبرات.

توصيات بشأن تصميم وتجميع دليل الكشف مدرجة في هذا البروتوكول. أحد الاعتبارات رئيسية في دليل تصميم الحمض النووي الريبي هو التقليل إلى أدنى حد آثار خارج الهدف. وقد وضعت عدة خوارزميات التنبؤ للسماح للمستخدمين كريسبر للوصول إلى الأدوات العملية الحسابية مع واجهات رسومية سهلة الاستخدام التي تنبئ بكل نشاط لدليل على الهدف وفرصة للآثار خارج الهدف34، 35،36. ميزة معينة للنظام الزرد خفض معدلات الآثار خارج الهدف نظراً Cas9 حقن الأجنة ولذلك فالتعبير عابرة، الذي أظهر في الفئران أن تسفر عن آثار خارج الهدف انخفضت53. ومع ذلك، أظهرت آثار خارج الهدف تحدث في الزرد54. طريقة واحدة لمراقبة الآثار خارج الهدف النمط الظاهري مؤسس الزرد التي تم إنشاؤها بواسطة اثنين من الكشف دليل المستقلة التي تستهدف نفس الجين، كما سيكون من المحتمل جداً أن تؤثر على مواقع مختلفة خارج الهدف هذه الأدلة. طريقة بديلة للتقليل من آثار خارج الهدف غير الموصوفة في هذا البروتوكول هو استخدام Cas9 تحور يقوم بإنشاء فواصل جديلة واحدة الهدف الحمض النووي، والتي يتم إصلاحها بكفاءة عالية. مزاوجة نيكس الحمض النووي داخل قربها من بعضها البعض تكون مكملة للعكس فروع النتائج في تشكيل إينديل فعالة في المكان المطلوب ويقلل من آثار خارج الهدف55،56.

بالإضافة إلى وجود أسعار مختلفة لتأثيرات خارج الهدف، يمكن أن يكون سجرناس مختلفة أسعار مختلفة للطفرات الهدف المطلوب57،،من5859. هذا البروتوكول يستخدم HMA إلى تحليل كفاءة الطفرات سجرنا معين استخدام هيتيرودوبليكس تشكيل الفرقة33،40. عصابات هيتيرودوبليكس يتم إنشاؤها بواسطة تهجين خيوط الحمض النووي المولدة بواسطة PCR التي تحتوي على حالات عدم التطابق، ويمكن حلها بسهولة باستخدام هلام التفريد. على عكس الأساليب الأخرى المستخدمة عادة لقياس تشكيل إينديل، مثل T7 endonuclease المقايسة أو عالية الدقة تذوب تحليل25،26، HMA لا تتطلب إنزيم مكلفة قطع الحمض النووي غير متطابقة، ولا تتطلب تحليل PCR معقدة تذوب المنحنيات. الأهم من ذلك، استخدام HMA للتحقق من معدلات عالية لتشكيل إينديل في حقن السكان كما تمكن المحقق للتقليل من عدد الأسماك اللازمة للإنتاج اللاحقة لخطوط المغلوب، مما يقلل من تكلفة تحديد طفرة مع الخصائص المرغوبة.

السهولة النسبية لتوليد إينديلس على أساس كريسبر يتيح إنشاء متعددة الآليلات الجينات متعددة في وقت واحد. تتوفر برامج المستندة إلى ويب لتحليل الطفرات واحدة من الأسماك متخالف استخدام سانغر التسلسل من منتجات PCR49. في الحالة حيث يتم تحليل ثلاثة أو أكثر من الآليلات تحور كريسبر، خ ع لوصف طبيعة إينديل المحتمل يكون أكثر فعالية من حيث التكلفة لوصف طبيعة إينديل كهذا النهج يتيح مجموعة الآليلات مختلفة تصل إلى 50 تتسم في س الامتحانات التنافسية الوطنية (انظر الجدول للمواد)60،،من6162. مثل اقتصاد الحجم الكبير يرجح مفيدة بشكل خاص في إعداد مختبرات جامعية.

وباختصار، يوفر هذا البروتوكول توجيهات خطوة بخطوة لتكاثر توليد عالية الجودة كريسبر-الكواشف (بخاصة، سجرنا) أن الأسماك الكبار أقل بحاجة إلى إنشاء وتحليلها لتحديد نجاح الآليلات متحولة للفائدة، مما كما يقلل الوقت والتكلفة لتوليد الخطوط المطلوبة. الأهم من ذلك، تم تصميم هذا البروتوكول بأنه يمكن تطبيقها من قبل مختبرات مع الموارد المحدودة لإنتاج الزرد متحولة بأسعار معقولة. وعلاوة على ذلك، لقد وجدنا أن هذا النهج هو مناسبة للطلاب الجامعيين، وهكذا يوسع الفرص للتعليم والتدريب للطلاب الجامعيين المهتمين بخبرة عملية في التحرير على أساس كريسبر الجينوم.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها في “المعاهد الوطنية للصحة” (R21CA182197 إلى J.O.)، دبليو رالف والثقة نعمة M. Showalter البحوث، “بوردو للعلوم الزراعية” وملحق لبرنامج “التنمية الاقتصادية” (أجسيد)، و. تم اقتناء سانغر التسلسل البيانات مرفق بوردو الجينوميات الأساسية مدعومة P30 CA023168. وأيد مريم ويتوكي مركز جامعة بوردو “السرطان الصيف البحوث الجامعية برنامج البحوث” تدعمه “جمعية السرطان مقاطعة كارول”. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. ونشكر بنيامين كارتر والين دينينغ ساباتو تايلور لتوفير تغذية مرتدة حرجة على المخطوطة. ونشكر قسم الكيمياء الحيوية لدعم هذا العمل، ومركز البحوث الزرد في جامعة بوردو لتفانيهم في العناية والرعاية من مستعمرة الزرد لدينا. أخيرا، نشكر “مرفق الأساسية علم الجينوم في بوردو”، ومساهمات فيليب سان ميغيل فيما يتعلق بخدمات خ ع.

Materials

CRISPOR sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/
Breaking-Cas sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChop sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3 PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free technique http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free water Any brand Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.
Rnase-free ethanol Any brand Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.
Cas9 Protein PNA Bio CP01 Cas9 protein with nuclear localization signal.
Target specific oligos Integrated DNA Technologies (IDT) Synthesize guide RNAs.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.
EnGen sgRNA Synthesis Kit New England BioLabs E3322 In vitro transccribe guide RNAs.
10X TBE Thermo Fisher B52 RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.
6X Load Dye New England BioLabs B7025S Loading DNA for electropheresis.
5M Ammonium acetate Thermo Fisher AM9071 Clean up reagent for purification of guide RNAs.
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any brand Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.
Nuclease-free Water Any brand For synthesis and purification of guide RNAs.
RNase away Thermo Fisher 10328011 Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.
DNA Ladder, 100 bp New England BioLabs N0467S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
DNA Ladder, 1 kb New England BioLabs N0552S Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
RNA Ladder New England BioLabs N0364S Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized
TEMED Thermo Fisher 17919 Casting polyacrylamide gel.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Casting polyacrylamide gel.
40% Polyacrylamide (19:1) BioRad 161-0154 Casting denaturing polyacrylamide gel.
Urea Sigma-Aldrich U5378-100G Casting denaturing polyacrylamide gel.
RNA Gel Loading Dye (2x) Thermo Fisher R0641 Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510-10ML Visualization of nucleic acids.
SYBER Green Thermo Fisher S7563 Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.
Microcentrifuge Eppendorf 5424 RNA clean up, PCR purification.
MyTaq Polymerase Bioline BIO-21105 For amplification of DNA using PCR.
Thermocycler Any brand PCR amplification.
Spectrophotometer Any brand NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.
E3 embryo media Made in house Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140 Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish Thermo Fisher FB0875711Z Store embryos, cast injection plate.
Agarose Denville CA3510-8 Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold Adaptive Science Tools TU-1 To create wells to hold embryos during injection.
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290  Dye for visualization of injection.
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5904-5ML To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes Any brand Moving embryos.
Razor blade Thermo Fisher 11295-10 Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator Any brand Maintaining embryos at 28.5 oC.
Verticle pipette puller David Kopf Instruments 700C Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes Sutter Instruments BF100-58-10 Geneate needles for injection.
Microloader tips Eppendorf 930001007 Load solution into injection needles.
Microinjector World Precision Instruments PV 820 Injecting embryos.
Disecting microscope Leica Injecting embryos.
30% Polyacylamide (29:1) BioRad 161-0156 Heteroduplex gel casting.
MS-222 (Tricaine) Sigma-Aldrich A-5040 Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Microwave Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Scale Any brand Casting injection plate, agarose gels.
Gloves Any brand For all aspects of the protocol.
N2 Any brand To expell liquid from the capillary for embryo injection.
1,000 µL  tips Any brand For all aspects of the protocol.
200 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
10 µL tips Any brand For all aspects of the protocol.
PCR strip tubes Any brand For all aspects of the protocol.
Micropipettes Any brand For all aspects of the protocol.
NGS Sequencing platform: Wideseq If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).
Software for sequence analysis For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software for sequence analysis SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci. 3 (8), 603-610 (2012).
  3. Shrivastav, M., De Haro, L. P., Nickoloff, J. A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Res. 18 (1), 134-147 (2008).
  4. Chapman, J. R., Taylor, M. R., Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  5. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 79, 181-211 (2010).
  6. Bee, L., Fabris, S., Cherubini, R., Mognato, M., Celotti, L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. PLoS One. 8 (7), e69061 (2013).
  7. Betermier, M., Bertrand, P., Lopez, B. S. Is non-homologous end-joining really an inherently error-prone process?. PLoS Genet. 10 (1), e1004086 (2014).
  8. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  10. Ata, H., Clark, K. J., Ekker, S. C. The zebrafish genome editing toolkit. Methods Cell Biol. 135, 149-170 (2016).
  11. Sertori, R., Trengove, M., Basheer, F., Ward, A. C., Liongue, C. Genome editing in zebrafish: a practical overview. Brief Funct Genomics. 15 (4), 322-330 (2016).
  12. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Adv Genet. 92, 1-52 (2015).
  13. Liu, Y., et al. A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruption in Xenopus tropicalis and zebrafish. Methods. 69 (1), 58-66 (2014).
  14. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res. 41 (14), e141 (2013).
  15. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Enriquez, P. CRISPR-Mediated Epigenome Editing. Yale J Biol Med. 89 (4), 471-486 (2016).
  18. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  19. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  20. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  21. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  22. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  23. Ota, S., Kawahara, A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders. Congenit Anom (Kyoto). 54 (1), 8-11 (2014).
  24. Samarut, E., Lissouba, A., Drapeau, P. A simplified method for identifying early CRISPR-induced indels in zebrafish embryos using High Resolution Melting analysis. BMC Genomics. 17, 547 (2016).
  25. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282 (2014).
  26. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  27. Prykhozhij, S. V., Rajan, V., Berman, J. N. A Guide to Computational Tools and Design Strategies for Genome Editing Experiments in Zebrafish Using CRISPR/Cas9. Zebrafish. 13 (1), 70-73 (2016).
  28. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
  29. Varshney, G. K., et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc. 11 (12), 2357-2375 (2016).
  30. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Sci Rep. 6, 34555 (2016).
  31. Vejnar, C. E., Moreno-Mateos, M. A., Cifuentes, D., Bazzini, A. A., Giraldez, A. J. Optimized CRISPR-Cas9 System for Genome Editing in Zebrafish. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2016).
  32. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), e98186 (2014).
  33. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  34. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  35. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
  36. Oliveros, J. C., et al. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W267-W271 (2016).
  37. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  38. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  39. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  40. Ota, S., Hisano, Y., Ikawa, Y., Kawahara, A. Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Genes Cells. 19 (7), 555-564 (2014).
  41. Hisano, Y., Ota, S., Kawahara, A. Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Dev Growth Differ. 56 (1), 26-33 (2014).
  42. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish. PLoS One. 10 (5), e0128319 (2015).
  43. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), (2009).
  44. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  45. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  46. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods Mol Biol. 127, 125-132 (1999).
  47. Yin, L., Maddison, L. A., Chen, W. Multiplex conditional mutagenesis in zebrafish using the CRISPR/Cas system. Methods Cell Biol. 135, 3-17 (2016).
  48. Yin, L., Jao, L. E., Chen, W. Generation of Targeted Mutations in Zebrafish Using the CRISPR/Cas System. Methods Mol Biol. 1332, 205-217 (2015).
  49. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Dev Dyn. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  50. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  51. Hwang, W. Y., et al. Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided Nucleases. Methods Mol Biol. 1311, 317-334 (2015).
  52. Gonzales, A. P., Yeh, J. R. Cas9-based genome editing in zebrafish. Methods Enzymol. 546, 377-413 (2014).
  53. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
  54. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  55. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  56. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  57. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  58. Ren, X., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep. 9 (3), 1151-1162 (2014).
  59. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods Enzymol. 546, 21-45 (2014).
  60. Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15, 1002 (2014).
  61. Jung, C., et al. Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips. Cell. 170 (1), 35-47 (2017).
  62. Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet. 30 (9), 418-426 (2014).

Tags

CRISPR/Cas9Gene KnockoutDanio RerioZebrafishTargeted Genome EditingIn Vitro TranscriptionSgRNAAmmonium Acetate PrecipitationEthanol PrecipitationRNA Purification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. J. Vis. Exp. (138), e56969, doi:10.3791/56969 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image